腫瘤壞死因子拮抗劑、糖皮質激素、結節對γ-干擾素釋放試驗檢測結果影響

李 洪，陸清平，陳 映，王妹妹，莫海花，王會玉, 郝曉柯

1.瓊海市人民醫院 檢驗科，海南 瓊海 571400;2.空軍軍醫大學西京醫院 檢驗科，陜西 西安 710032

γ-干擾素釋放試驗(interferon-γ release assays，IGRAs)選用外周血作為樣本，并應用結核分枝桿菌特異抗原早期分泌抗原靶6與培養濾液蛋白10進行檢測，不受卡介苗接種、非結核分枝桿菌感染的影響，提高了檢測的敏感度和特異性，可以用于結核病的輔助診斷與結核分枝桿菌潛伏感染的檢測[1]。目前，國際上較成熟的IGRAs有酶聯免疫法檢測與酶聯免疫斑點法(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)檢測。腫瘤壞死因子α是一類導致自身免疫性及抗菌性炎癥疾病的關鍵細胞因子[2-3]。糖皮質激素具有抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克等作用，是風濕性疾病、自身免疫病的最基本的治療藥物之一[4-5]。地塞米松是一類常用的長效糖皮質激素。IGRAs基于體外釋放試驗，通過檢測釋放γ-干擾素的特異T細胞的數量或特異T細胞釋放的γ-干擾素的濃度輔助診斷，而免疫抑制劑的使用可能會影響T細胞活性，從而導致假陰性[6]。本研究旨在探討腫瘤壞死因子拮抗劑、糖皮質激素、結節對IGRAs檢測結果的影響，以期為該類方法在綜合性醫院各科室結核感染的篩查提供實際的參考價值和應用思路。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取瓊海市人民醫院2019年1—10月進行IGRA檢測的221例患者為研究對象。其中陽性124例，陰性97例。在陽性患者中排除已知的免疫缺陷、接受過免疫抑制藥物治療或糖尿病患者后，隨機選取104例(男性55例，女性49例)作為藥物影響試驗標本。

1.2 研究方法 所有患者采集肝素抗凝血8 ml后，進行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離與提取。將收集的細胞懸液進行活細胞計數，確保每100 μl細胞懸液含25萬個細胞。每個標本設置陰性對照N、陽性對照P及兩個刺激抗原管TA、TB，分別加入相應抗原及細胞懸液后按說明書步驟進行檢測。將104例標本隨機分為4組，每組各26例。對照組，PBMCs中均不添加任何藥物；地塞米松組，PBMCs中添加2.0 μg/ml地塞米松[7]；英夫利昔單抗組，PBMCs中添加5.0 μg/ml英夫利昔單抗[8]；依那西普組，PBMCs中添加1.5 μg/ml依那西普。根據不同年齡將221例患者分為年齡<15歲組(n=34)、16～30歲組(n=35)、31～45歲組(n=33)、46～60歲組(n=35)、61～75歲組(n=52)、年齡>75歲組(n=32)。根據不同科室將221例患者分為呼吸內科組(n=83)、內分泌風濕免疫科組(n=32)、感染性疾病科組(n=33)、腫瘤-血液-普通內科組(n=28)、兒科組(n=16)、消化內科組(n=29)。分析并比較不同年齡、科室患者的ELISPOT陽性率。

1.3 結果判斷 陽性：陰性對照孔斑點數<6，且抗原A/抗原B檢測孔斑點數-陰性對照孔斑點數≥6；陰性對照孔斑點數≥6，且抗原A/抗原B檢測孔斑點數≥2倍陰性對照孔斑點數。陰性：不符合陽性判定結果，且陽性對照孔結果正常。

2 結果

2.1 不同藥物對ELISPOT的影響 地塞米松組、英夫利昔單抗組均有1例陽性標本轉為陰性，而對照組和依那西普組均為陽性。對照組、地塞米松組、英夫利昔單抗組、依那西普組平均斑點數分別為(61.5±10.4)個、(60.8±10.5)個、(57.5±9.8)個、(61.3±10.8)個，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 不同年齡、科室患者ELISPOT陽性率比較 年齡<15歲組、16～30歲組、31～45歲組、46～60歲組、61～75歲組、年齡>75歲組患者ELISPOT陽性率分別為5.9%(2/34)、31.4%(11/35)、33.3%(11/33)、34.3%(12/35)、28.8%(15/52)、28.1%(9/32)。年齡<15歲組患者ELISPOT陽性率顯著低于其他各組，差異均有統計學意義(P<0.05)。呼吸內科組、內分泌風濕免疫科組、感染性疾病科組、腫瘤-血液-普通內科組、兒科組以及消化內科組患者的ELISPOT陽性率分別為34.9%(29/83)、25.0%(8/32)、30.3%(10/33)、25.0%(7/28)、6.3%(1/16)、17.2%(5/29)。其中，呼吸內科組的ELISPOT陽性率最高，兒科組的陽性率最低。呼吸內科組的ELISPOT陽性率顯著高于兒科組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

隨著醫學進步與免疫學的不斷發展，IGRAs的應用為結核病診斷開辟了新途徑，該技術具有操作簡單、儀器設備要求低、檢測周期短等特點[9]。有研究報道，地塞米松或英夫利昔單抗治療的患者進行ELISPOT檢測均有假陰性風險，但由于進行IGRAs的方法不同，結果受藥物影響的程度有所不同[10-11]。本研究結果發現,地塞米松組、英夫利昔單抗組均有1例陽性標本轉為陰性；對照組、地塞米松組、英夫利昔單抗組、依那西普組平均斑點數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。這一結果表明，ELISPOT法更不易受糖皮質激素類藥物及腫瘤壞死因子拮抗劑的影響，結果更可靠。

本研究結果顯示，年齡<15歲組患者ELISPOT陽性率顯著低于16～30歲組、31～45歲組、46～60歲組、61～75歲組、年齡>75歲組，差異均有統計學意義(P<0.05)；呼吸內科的ELISPOT陽性率最高，兒科的陽性率最低，且呼吸內科組的ELISPOT陽性率高于兒科組，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，兒童群體的ELISPOT的假陰性發生的概率較大，這可能是由于兒童自身的免疫力低下，ELISPOT檢測在出現不確定結果的比例明顯升高，與卜范峰等[12]研究結果一致。因此，兒童肺結核患者臨床診斷過程中仍應重視病史、臨床表現、胸部CT征象及變化，重視痰結核菌涂片及痰結核菌培養等基礎檢測手段，應反復多次送檢，不能因其陽性率低、培養時間長等缺點而否定其重要性。本研究樣本量有限，仍需大樣本研究加以證實。

綜上所述，ELISPOT受糖皮質激素與腫瘤壞死因子拮抗劑的影響不大，其檢測結果容易受年齡的影響，對于兒童患者ELISPOT陰性需謹慎對待。