干細胞療法在血友病性關節炎治療中的應用進展

沈紹寧，吳東曉，呂帥潔，肖魯偉，童培建

(1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江省中醫院，浙江 杭州 310006)

血友病是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，可分為血友病A和血友病B，前者為凝血因子Ⅷ缺乏、后者為凝血因子Ⅸ缺乏，均由相應的凝血因子基因突變引起[1]。該病的主要臨床表現為出血。血友病性關節炎(hemophilic arthritis，HA)是由血友病患者(people with hemophilia，PWH)關節腔內反復出血而引起的關節退行性變和滑膜炎癥，是血友病主要的并發癥之一，嚴重影響PWH的生活質量。目前，臨床上治療HA的方法主要為預防出血和骨科手術。凝血因子替代治療是目前預防血友病出血的主要方法[2]，然而替代治療價格昂貴，在發展中國家的應用受到限制；該療法主要對尚未發生關節炎的兒童PWH具有預防作用，而對已經發生關節炎的PWH，提高凝血因子水平難以延緩病情進展，需采用骨科手術治療[3]。目前，亟需尋求一種新的有效方法來延緩HA病情進展。干細胞是具有多向分化潛能的細胞，在再生醫學領域備受關注。近年來，有關干細胞療法治療HA的研究[4-6]取得了顯著成果，并已證明此療法可以修復骨與軟骨缺損，延緩HA病情進展。本文就干細胞療法在HA治療中的應用進展綜述如下。

1 治療HA的干細胞類型

目前，用于治療HA的干細胞類型主要包括造血干細胞(hemopoietic stem cell，HSC)與間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。HSC是血液系統中具有長期自我更新能力和分化成各類成熟血細胞潛能的成體干細胞。HSC作為基因載體細胞，可以用于HA的基因治療。MSC是源于中胚層的具有自我更新和分化潛能的多能祖細胞，其來源豐富，可從骨髓、脂肪、臍帶、軟骨等中分離獲取。MSC關節腔內移植法在骨關節炎等疾病的治療中已被證明具有修復軟骨和延緩病情進展的作用，但目前臨床上尚無MSC關節腔移植治療HA的報道。有研究[4，7]表明，MSC關節腔移植能有效減少關節腔內出血、促進骨與軟骨修復、延緩關節炎病情進展，可成為治療HA的有效方法。

2 基于HSC的基因治療

2.1 基于HSC的基因治療的優勢將能正常表達凝血因子基因的病毒載體在體外轉導至靶細胞，再輸入患者體內的方法，稱之為間接基因治療法。隨著研究的不斷深入，許多體細胞被用于HA的基因治療，如成纖維細胞、血管內皮細胞、肝細胞等，但仍存在細胞活力喪失、難以持續表達等問題[8]。基于HSC的靶向血小板表達凝血因子Ⅷ的基因治療是目前最具潛力的治療策略[9]。將能正常表達凝血因子Ⅷ的基因通過慢病毒載體或CRISPR/Cas9、TALEN等基因編輯工程技術[10]轉導至HSC，在體外富集增殖后，再將其注入患者體內，HSC將分化形成包含血小板在內的血細胞，在巨核細胞和血小板特異的啟動子控制下，凝血因子Ⅷ特異性表達并儲存于血小板中，從而實現治愈HA的目的。基于HSC的基因治療相較于直接輸注病毒載體及其他體細胞基因治療具有以下優勢：①凝血因子替代治療與一般基因治療的凝血因子均表達于血漿中，因此對于臨床上存在中和抗體的患者，這2項治療均不能取得良好的效果；而基于HSC的基因治療，在巨核細胞和血小板特異性啟動子(包括GPαIIb啟動子、GPαIb啟動子、血小板因子4啟動子)的控制下，凝血因子Ⅷ特異性表達并儲存于血小板α顆粒中，減少了其在血液循環中的暴露時間，避免受到中和抗體的抑制作用，對于存在中和抗體的患者同樣有效。②血小板可在表達凝血因子Ⅷ的同時表達血管性血友病因子(von willebrand factor，VWF)，二者結合形成VWF和凝血因子Ⅷ復合物，并與血管內皮膠原進一步結合，提高血栓穩定性。③HSC持續表達凝血因子Ⅷ的能力更強。王大威[11]通過小鼠實驗發現，往小鼠體內注射的HSC可參與造血系統的發育，持續表達凝血因子Ⅷ，甚至在二次移植后仍能保持這一能力。

2.2 基于HSC的基因治療的安全性基于HSC的基因治療的安全性是目前的熱點問題。首先，體外基因編輯及細胞培養增殖過程中由于基因突變及拷貝數變異等問題[12]，存在發生基因組改變的風險，且在后續治療中存在致癌的危險。盡管許多動物實驗未發現通過HSC基因治療后存在致癌現象，但這一問題仍應引起重視。其次，以胚胎干細胞或誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)為來源誘導分化為HSC的過程中，因在體外難以模擬生理狀況下HSC分化的微環境[13]，所以很難實現HSC準確定向分化。王大威[11]通過iPSC體內分化畸胎瘤細胞的方法分化形成以髓系及淋系終末造血細胞為終點的HSC。但由于體內分化存在不可控性以及畸胎瘤本身的類癌風險性，靶向血小板的基因治療在臨床上應用面臨巨大挑戰。對于老年PWH，在動脈粥樣硬化等風險增大的前提下，靶向血小板表達凝血因子Ⅷ的基因治療是否會增加老年PWH血栓形成風險仍不明確[14]。為了評估靶向血小板的基因治療的安全性，Baumgartner等[15]建立了高于凝血因子最低治療量30倍的轉基因小鼠模型，并評估了與血栓形成相關的各項參數，結果顯示血小板高濃度表達凝血因子Ⅷ增加轉基因小鼠血栓形成的風險。今后仍需更多的動物實驗及臨床研究來進一步驗證基于HSC的基因治療的安全性。

2.3 基于HSC的基因治療存在的問題血友病作為單基因缺陷疾病是基因治療的首選疾病之一。Nathwani等[16]通過對血友病B患者靜脈注射能夠表達凝血因子Ⅸ的腺相關病毒載體8(adeno associated virus，AAV8)，成功地進行了血友病B基因治療的Ⅰ期臨床試驗研究。但是，通過直接注射病毒載體的方式仍存在許多問題。首先，AAV8病毒載體表達的凝血因子于血液循環中，若PWH存在中和抗體，難以避免受到中和抗體的抑制作用[17]。其次，大部分PWH因長期輸血或使用血液制品，存在感染肝炎病毒或HIV病毒的風險，易導致基因治療失敗。此外，在凝血因子Ⅷ或Ⅸ基因成功導入肝細胞后常伴隨谷氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)升高隨即凝血因子表達下降的情況，難以實現基因持續表達[16]。以往由于凝血因子Ⅷ基因過于龐大(編碼區長度約為7.0 kb，超過了插入AAV的允許范圍)，且全長凝血因子Ⅷ蛋白的細胞表達率較差等原因，血友病A的基因治療被認為比血友病B更具挑戰性。Valoctocogene roxaparvovec療法又名BMN270療法，是一種使用AAV5病毒載體遞送表達凝血因子Ⅷ基因的創新基因療法，該療法的出現給血友病A患者帶來新希望。BMN270是一種無復制能力的AAV5基因載體，包括位于其5'和3'末端的雙鏈反向末端重復序列，以及編碼雜合人類肝臟特異性啟動子的單鏈DNA、B結構域缺失的人凝血因子Ⅷ cDNA和合成型聚腺苷酸化信號[18-19]。ALT升高是BMN270基因療法最常見的不良反應，需使用激素加以控制。此外，BMN270基因療法對于存在凝血因子Ⅷ抑制物病史患者的療效仍不確切。目前，BMN270基因療法的基礎研究仍存在較多局限性，需要更多的臨床研究以驗證其長期療效及安全性[20]。

3 基于MSC的細胞治療

對于已發生關節病變的PWH，雖然基因治療可以提高患者凝血因子水平，避免自發性出血，但是難以遏制關節病變的進展[21]。鑒于此，Kashiwakura等[22]提出了基于MSC的細胞治療。基于MSC的細胞治療已經在骨關節炎的治療中取得了顯著成效[23]。HA與骨關節炎在病理機制上存在相似性，且大量動物實驗研究[4，6，22]也證實了基于MSC的細胞治療對HA有相當的療效。

3.1 基于MSC的細胞治療的作用機制與骨關節炎的細胞治療不同，HA的細胞治療需將表達正常凝血因子Ⅷ和Ⅸ基因的病毒載體轉導至MSC，體外富集增殖后再輸入患者關節腔內。從HA的發病機制出發，HA治療的潛在目標包括含鐵血黃素清除、炎癥消除、血管重塑及骨與軟骨修復[24]。基于MSC的細胞治療機制與HA治療的潛在目標有著較高的契合度，主要包括止血、免疫調節及骨與軟骨修復。

3.1.1止血 HA發生發展的關鍵在于關節腔內反復出血，而出血產生的含鐵血黃素將沉積于滑膜并引起炎癥，Fe2+刺激滑膜薄層轉化為肥大的絨毛膜。由于炎癥與增生滑膜的需氧量增加，刺激血管內皮生長因子的表達，導致滑膜新生血管形成，而新生血管更容易受到損傷而引發出血。因此，出血-增生滑膜-新生血管這一惡性循環是加劇HA進展的主要原因。基于MSC的細胞治療有望打破這一惡性循環，因為MSC在關節腔內呈高濃度，當出血發生時，高濃度的凝血因子被及時釋放而用于止血，在血漿凝血因子Ⅷ水平未增加的情況下，基于MSC的細胞治療仍能有效進行止血。與凝血因子替代治療相比，MSC移植治療的優勢是持續地產生凝血因子而非突然地大量增加凝血因子，這也有利于避免凝血因子抗體的產生。

3.1.2免疫調節 免疫調節作用機制包括分泌免疫抑制性細胞因子配體和受體以及直接調節免疫細胞分化來調節免疫反應[25]。首先，炎癥因子干擾素γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α和白介素( interleukin，IL)1β等能刺激MSC表達免疫抑制劑、程序性細胞死亡配體1(programmed cell death Ligand 1，PD-L1)和PD-L2以及下調免疫球蛋白樣轉錄物受體，從而抑制炎癥反應[26]。其次，MSC還可通過其表達的免疫調節因子來調節多種類型的免疫細胞，從而達到抗炎的目的。MSC不僅抑制高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白CD34和HSC的單核細胞分化[27]，還可以通過吲哚胺2,3-二加氧酶、CC基序配體18和前列腺素E2誘導巨噬細胞從促炎切換到抗炎[28]，表達高水平的免疫抑制因子(如IL-10)和低水平的免疫激活劑(如IL-6，IL-12，TNF-α ，IL-1β，IL-23，CD86)。活化的MSC分泌免疫抑制蛋白TNF-α刺激基因6(TNF-α stimulated gene 6，TSG-6)，并抑制新分化的巨噬細胞的活化。TSG-6與巨噬細胞上表達的CD44相互作用并減少核因子-κB的核易位[29]。此外，MSC可以根據微環境，釋放抑制因子、刺激因子或表達其他表面分子，抑制B細胞、T細胞、NK細胞等活性，發揮其免疫調節功能，從而降低炎癥反應。

3.1.3骨與軟骨修復 MSC的分化作用與旁分泌作用是骨與軟骨修復的主要作用機制。MSC微環境在其中起到了重要作用，主要指分子及細胞層面的基質細胞、微循環、信號轉導通路等多方面多層次組成的MSC生存環境[30]。HA的病情進展與骨質疏松和骨質破壞有著密切關系，而MSC所具有的成骨、成軟骨分化能力有助于骨質疏松和骨質破壞的改善。在MSC的成骨、成軟骨分化過程中微環境起到了決定性作用。在MSC的成骨分化機制中，BMP信號通路、Wnt 信號通路、Notch 信號通路、整合素家族、非編碼RNA 包括長鏈非編碼RNA、微小 RNA和環狀 RNA均起著重要作用[28]。此外，微環境產生的空間邊界條件因素對成骨分化也具有重要作用。研究發現，在直徑為100 μm和150 μm空間邊界條件下培養的MSC具有更強的成骨分化能力[31]。MSC的成軟骨分化，除受Wnt 信號通路、Notch 信號通路等調控外，還受到包括Sox家族的Sox9、T-box 轉錄因子家族的Brachyury、C-myc、ERG和Runx2等轉錄因子的調控。因此，對下游信號通路及轉錄因子的調控是促進MSC成骨、成軟骨分化的關鍵。

既往學者們認為，MSC是通過分化骨細胞、軟骨細胞進而替代原有損傷組織來修復骨與軟骨缺損的。但是，近年來的研究發現，MSC是通過旁分泌作用特別是外泌體調節微環境來促進其自身修復的[32-33]，而非簡單地進行新舊細胞的更替。外泌體通過對多條信號通路及細胞因子的調控(如蛋白激酶B、細胞外調節蛋白激酶、Wnt信號通路、微小RNA等)來抑制軟骨細胞凋亡、促進損傷軟骨細胞修復及促進軟骨細胞增殖。

3.2 基于MSC的細胞治療存在的問題理想的基于MSC的細胞治療應為移植后的MSC能長期穩定地表達凝血因子，然而多項已經通過移植MSC治療成功提高了凝血因子水平的動物實驗均未能實現凝血因子的長期持續表達，其原因可能為細胞生存能力喪失或出現了抑制抗體[34]。由于很難實現凝血因子長期持續表達這一理想目標，HA患者可能需要定期地進行MSC移植治療，這無疑是對關節的重復損傷，并且還增加了感染的風險。此外，Kashiwakura等[4]的研究結果表明，能表達凝血因子Ⅷ的MSC移植治療會導致凝血因子Ⅷ抗體滴度升高，這意味著此項治療可能會增加PWH凝血因子Ⅷ抗體滴度。今后仍需進行更多的動物實驗及臨床研究來進一步驗證基于MSC的細胞治療的安全性。

4 小 結

基于干細胞的基因治療與細胞治療為HA的治療提供了新的思路。腺相關病毒載體(AAV5、AAV8)介導的基因治療已經在臨床上取得一定的成果，但存在受抑制物影響、ALT升高及凝血因子難以持續表達等問題。基于HSC的靶向血小板基因治療有望突破這些局限，但仍難以逆轉HA的進展。基于MSC的細胞治療或將成為HA的主流治療方法，因其可以有效止血并通過抑制炎癥反應、促進骨與軟骨修復等機制延緩甚至逆轉HA的進展。目前，基于MSC的細胞治療仍未應用于HA的臨床治療，因此其注射方式、劑量、優化療效途徑及安全性問題是今后亟需解決的問題。