川芎嗪對人骨關節炎軟骨細胞的影響及作用機制研究

王會含，王永堂，苗建華，李鳳新

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450007)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)多發于老年人，臨床主要病理表現為關節軟骨退變和關節邊緣骨質增生[1-2]。隨著人們預期壽命的延長，OA的發病率逐年上升，而其發病機制目前尚未明確。研究發現，軟骨細胞凋亡在OA的發生過程中起重要作用，阻止或減緩軟骨細胞凋亡是防治OA的關鍵[3-4]。近年來，臨床多采用以活血和補肝益腎為主的中藥防治OA，川芎是常用藥物之一[5-6]。川芎嗪是從川芎中分離的一種生物堿，朱海泉等[7]研究表明其能夠有效預防OA。為了探索川芎嗪對OA軟骨細胞凋亡的影響及其作用機制，我們開展了相關的實驗研究，現總結報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料膝關節軟骨組織來自在鄭州大學附屬鄭州中心醫院接受膝關節置換的患者。試驗方案經醫院醫學倫理委員會審查通過。

1.2 實驗試劑Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)購自武漢益普生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶、多聚甲醛溶液、二甲亞砜(美國Sigma公司)，DMEM培養基(美國HyClone公司)，10%的胎牛血清、苯基甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)購自北京孚博生物科技有限公司，甲苯胺藍(北京索萊寶科技有限公司)，鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白一抗(美國Santa Cruz公司)，生物素標記的山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(美國Biotium公司)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α(福州邁新生物技術開發有限公司)，川芎嗪(純度≥98%，成都德思特生物技術有限公司)，異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FIIC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染色試劑盒、Promega逆轉錄試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，MTT分析試劑盒(美國Thermo公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料法熒光定量試劑盒(日本Takara公司)，擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，兔抗人硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)-2、凋亡信號調節激酶(apoptosis signal regulating kinase，ASK)-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase)-3、β-肌動蛋白(β-actin)一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、電化學發光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)試劑盒(美國Abcam公司)。

1.3 實驗儀器TD-4M臺式低速離心機(山東博科生物產業有限公司)，恒溫培養箱(上海喆圖科學儀器有限公司)，AE31 EF-INV型熒光顯微鏡(上海光學儀器廠)，DG5031酶聯免疫監測儀(南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司)，Amnis流式細胞分析儀(美國BD公司)，ABI7900實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 軟骨細胞分離和培養方法將一定量的軟骨組織，使用HBSS沖洗干凈，剪碎后移入直徑10 cm的培養皿中，加入10 mL含0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM培養基，于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養箱中。消化4～6 h后，將含有軟骨組織塊的液體移入15 mL離心管，以1200 r·min-1(離心半徑8 cm)離心5 min。棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基?；靹蚝螅臃N于25 cm2貼壁式細胞培養瓶，將培養瓶置于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養箱中培養，每48 h更換1次培養基，待約90%細胞貼壁時進行傳代。按照1∶2的比例進行傳代，每隔3 d傳代1次。于顯微鏡下觀察原代細胞及第3代細胞形態。

2.2 軟骨細胞鑒定方法取生長良好的第3代軟骨細胞，接種于預先放置爬片的6孔板上，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基。待約70%細胞貼壁時，取出細胞爬片，用PBS洗滌3次，加入 1 mL 濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液，置于4 ℃冰箱過夜固定。取出爬片，分別進行甲苯胺藍染色和免疫組化染色，免疫組化染色一抗為鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，使用比例為1∶100，二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG，使用比例為1∶1000。染色后分別于顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 OA軟骨細胞模型建立與川芎嗪干預方法取生長良好的第3代軟骨細胞，采用細胞計數法測定細胞濃度，調整細胞濃度為1×106個·mL-1。將軟骨細胞分別接種至4塊6孔板中，每塊板接種5個復孔，每個復孔接種1 mL。每孔加入1 mL濃度為100 ng·mL-1的TNF-α，于CO2濃度5%、溫度 37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h以建立OA軟骨細胞模型[8]。培養結束后，將4塊6孔板隨機分為對照組和川芎嗪低、中、高濃度組。用吸管小心棄去培養基，對照組加入1 mL正常的DMEM培養基，川芎嗪低、中、高濃度組分別加入1 mL含川芎嗪濃度為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1的DMEM培養基，于CO2濃度5%、溫度37 ℃的恒溫培養箱中繼續培養24 h。

2.4 軟骨細胞凋亡率測定方法按照2.3的方法進行OA軟骨細胞模型建立與川芎嗪干預，取干預后的軟骨細胞懸液，采用細胞計數法測定細胞濃度，調整細胞密度為1×106個·mL-1。取100 μL細胞懸液加入流式管中，再加入5 μL Annexin V-FIIC溶液、5 μL PI溶液及0.5 mL上樣緩沖液，混勻后避光放置15 min，采用流式細胞儀測定軟骨細胞凋亡率。

2.5 軟骨細胞活力測定方法按照2.3的方法進行OA軟骨細胞模型建立與川芎嗪干預，干預結束后，在每孔中加入濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，用吸管小心棄去培養基，每孔加150 μL二甲亞砜，振蕩至結晶物完全溶解。采用DG5031酶聯免疫監測儀測定各孔吸光度，測定波長490 nm。

2.6 軟骨細胞凋亡相關基因mRNA表達分析方法按照2.3的方法進行OA軟骨細胞模型建立與川芎嗪干預，采用Trizol法提取干預后軟骨細胞的總RNA，參照Promega逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄獲得cDNA模板。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ染料法熒光定量試劑盒進行實時定量PCR擴增，Trx-2、ASK-1、Caspase-3及β-actin基因擴增引物序列見表1，反應體系參照試劑盒說明書，PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸35 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算Trx-2、ASK-1及Caspase-3 mRNA的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列

2.7 軟骨細胞凋亡相關基因的蛋白表達分析方法按照2.3的方法進行OA軟骨細胞模型建立與川芎嗪干預，將干預后各組軟骨細胞以無菌PBS清洗2次；加入適量的含PMSF(濃度為1 mmol·L-1)的RIPA裂解液后，轉移至預冷的EP管中，于冰上裂解20 min；于4 ℃下以12000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清。采用BCA蛋白定量分析試劑盒測定上清蛋白濃度，調整樣品蛋白濃度使蛋白上樣量一致，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，采用蛋白印跡法檢測Trx-2、ASK-1、Caspase-3及β-actin的蛋白表達量，加入兔抗人Trx-2、ASK-1、Caspase-3一抗(1∶1000)和β-actin一抗(1∶800)，于4 ℃過夜孵育；洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶3000)。采用ECL試劑盒顯色，于E-Gel Imager凝膠成像儀中顯影并拍攝照片。采用Image J圖像處理軟件處理圖片，提取蛋白條帶的灰度值，分別以β-actin為參照，計算蛋白條帶的相對灰度值，分析蛋白表達水平。

2.8 數據統計方法采用SPSS24.0統計學軟件處理數據。4組軟骨細胞凋亡率、活力吸光度值及 Trx-2、ASK-1、Caspase-3的mRNA和蛋白相對表達量的組間比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結 果

3.1 軟骨細胞培養結果原代細胞培養至第15天，可見組織塊周圍有細胞成簇生長，顯微鏡下觀察細胞形態顯示細胞呈梭形、三角形或多角形[圖1(1)]；顯微鏡下觀察第3代軟骨細胞形態顯示，細胞多呈長梭形[圖1(2)]。

圖1 軟骨細胞形態觀察結果(×100)

3.2 軟骨細胞鑒定結果甲苯胺藍染色顯示，細胞呈長梭形，有1～3個細胞核，細胞質呈藍色[圖2(1)]；免疫組化染色顯示，細胞Ⅱ型膠原蛋白呈陽性，細胞質內可見黃色顆粒，細胞核無著色[圖2(2)]，表明為軟骨細胞。

圖2 第3代軟骨細胞鑒定結果(×200)

3.3 軟骨細胞凋亡率測定結果4組軟骨細胞凋亡率比較，差異有統計學意義[(25.10±0.47)%，(22.08±0.25)%，(19.37±0.36)%，(16.05±0.58)%，F=13.776，P=0.000]。川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細胞凋亡率均低于對照組(LSD-t=12.685，P=0.000；LSD-t=21.642，P=0.000；LSD-t=27.107，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細胞凋亡率均低于川芎嗪低濃度組(LSD-t=13.826，P=0.000；LSD-t=21.349，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細胞凋亡率低于川芎嗪中濃度組(LSD-t=10.875，P=0.000)。見圖3。

圖3 4組骨關節炎軟骨細胞凋亡率測定結果

3.4 軟骨細胞活力測定結果4組軟骨細胞活力比較，差異有統計學意義(吸光度值：0.25±0.04，0.41±0.02，0.54±0.02，0.60±0.01，F=131.875，P=0.000)，川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細胞活力均高于對照組(LSD-t=8.000，P=0.000；LSD-t=14.500，P=0.000；LSD-t=18.981，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細胞活力均高于川芎嗪低濃度組(LSD-t=10.277，P=0.000；LSD-t=19.000，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細胞活力高于川芎嗪中濃度組(LSD-t=6.000，P=0.000)。

3.5 軟骨細胞凋亡相關基因mRNA和蛋白表達分析結果4組軟骨細胞Trx-2、ASK-1及Caspase-3的mRNA和蛋白相對表達量比較，組間差異均有統計學意義。川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細胞Trx-2的mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組(mRNA：LSD-t=6.925，P=0.000；LSD-t=15.581，P=0.000；LSD-t=16.046，P=0.000；蛋白：LSD-t=2.479，P=0.000；LSD-t=23.000，P=0.000；LSD-t=33.988，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細胞Trx-2的mRNA和蛋白相對表達量均高于川芎嗪低濃度組(mRNA：LSD-t=7.044，P=0.000；LSD-t=9.581，P=0.000；蛋白：LSD-t=6.149，P=0.000；LSD-t=15.321，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細胞Trx-2的mRNA和蛋白相對表達量均高于川芎嗪中濃度組(LSD-t=3.994，P=0.004；LSD-t=18.605，P=0.000)；川芎嗪低、中、高濃度組軟骨細胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對表達量均低于對照組(mRNA：LSD-t=8.808，P=0.000；LSD-t=10.398，P=0.000；LSD-t=19.350，P=0.000；LSD-t=3.796，P=0.000；LSD-t=5.096，P=0.000；LSD-t=10.028，P=0.000；蛋白：LSD-t=5.041，P=0.001；LSD-t=13.466，P=0.000；LSD-t=21.719，P=0.000；LSD-t=2.481，P=0.038；LSD-t=7.286，P=0.001；LSD-t=16.865，P=0.000)，川芎嗪中、高濃度組軟骨細胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對表達量均低于川芎嗪低濃度組(mRNA：LSD-t=3.385，P=0.000；LSD-t=20.466，P=0.000；LSD-t=3.400，P=0.000；LSD-t=9.701，P=0.000；蛋白：LSD-t=8.296，P=0.000；LSD-t=17.303，P=0.000；LSD-t=6.228，P=0.000；LSD-t=17.365，P=0.000)，川芎嗪高濃度組軟骨細胞ASK-1和Caspase-3的mRNA和蛋白相對表達量均低于川芎嗪中濃度組(mRNA：LSD-t=9.550，P=0.005；LSD-t=3.619，P=0.007；蛋白：LSD-t=14.017，P=0.005；LSD-t=4.985，P=0.001)。見表2、圖4。

Trx：硫氧還蛋白；ASK：凋亡信號調節激酶；Caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；β-actin：β-肌動蛋白；(1)對照組；(2)川芎嗪低濃度組；(3)川芎嗪中濃度組；(4)川芎嗪高濃度組。

表2 4組骨關節炎軟骨細胞Trx-2、ASK-1及Caspase-3 mRNA和蛋白相對表達量

4 討 論

OA是一種以關節軟骨磨損和關節邊緣骨質增生為主要病理特征的關節疾病[9]。軟骨組織中沒有神經血管，軟骨細胞增殖與凋亡的平衡維系著軟骨的生理狀態[10-11]。在OA病理狀態下，軟骨細胞增殖與凋亡間的平衡被打破，軟骨細胞表現出過度凋亡，加速了軟骨的破壞[12]。研究表明，細胞凋亡相關因子在OA的發生發展過程中發揮重要作用，其能夠促進軟骨細胞基質金屬蛋白酶的表達，抑制膠原蛋白和蛋白多糖的合成與分泌，導致關節軟骨損傷，加速OA的進程[13-14]。因此，抑制軟骨細胞的凋亡進程對于防治OA具有重要意義。川芎嗪是從川芎中分離出來的一種生物堿。Fan等[15]研究發現，對于由高半胱氨酸誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡，川芎嗪可減輕細胞的氧化損傷，抑制細胞凋亡。曾利紅等[16]研究發現，川芎嗪能夠有效抑制OA大鼠軟骨細胞凋亡，在阻止OA病情發展方面療效顯著。我們研究發現，隨著川芎嗪濃度增加，OA軟骨細胞凋亡率下降、活力提高，提示川芎嗪能夠抑制人軟骨細胞凋亡、提高細胞活力，且該作用在一定濃度范圍內呈濃度依賴性。

細胞凋亡機制復雜，Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號通路是細胞凋亡的重要通路之一。Trx是一類重要的氧化還原調節分子，廣泛存在于生物體內；Trx-2是Trx家族成員，在調控細胞凋亡及氧化應激方面發揮著重要作用[17]。ASK-1是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，活化后的ASK-1能夠激活細胞凋亡通路，而ASK-1在細胞內與Trx-2結合形成復合物，可降低自身活性[18]。Caspase家族在細胞凋亡過程中發揮重要作用，其中Caspase-3是細胞凋亡的執行者之一，其活化后細胞凋亡將進入不可逆階段，生理狀態下Caspase-3以無活性酶原形式存在于細胞質中，Trx-2/ASK-1復合物可抑制Caspase-3活化[19]。外界信號可通過多種通路激活Caspase-3酶原，促使細胞凋亡，其中Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號通路在細胞凋亡過程中發揮重要作用[18]。本研究發現，與對照組比較，川芎嗪干預后關節炎軟骨細胞中 Trx-2 的mRNA和蛋白表達量均升高，而ASK-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表達量均降低；提示川芎嗪通過調控Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號通路發揮抑制軟骨細胞凋亡的作用。

本研究結果表明，川芎嗪能夠抑制人OA軟骨細胞的凋亡，提高軟骨細胞活力，且該作用在一定濃度范圍內呈濃度依賴性；其作用機制可能與調控Trx-2/ASK-1/Caspase-3信號通路有關。