非洲豬瘟病毒的侵染機制及疫苗研究進展

牟 豪，趙光夫，余遠迪，許國洋，楊 柳*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.四川大學 生命科學學院，四川 成都 610064;3.重慶市獸用生物制品工程技術研究中心,重慶 榮昌 402460)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)屬于雙鏈DNA病毒，基因組為170～193 kb，無內含子，共編碼150～167個病毒蛋白。ASFV是一種對于養豬業危害極其嚴重的病毒，具有高致死性和強傳染性的特點，每年該病對世界養豬業造成了數十億美元的經濟損失。在我國，ASFV屬于一類動物疫病，同時在國際上也屬于世界動物衛生組織(OIE)管制檢測疫病類型。ASFV的宿主特異性比較強，主要感染豬，包括家豬和野豬，不能感染人類，故不屬于人畜共患病。該病毒在臨床上可引起肺水腫、發燒、皮膚發紺、臟器黏膜出血等癥狀，其高毒力毒株能在短時間內導致豬的發病死亡，病死率高達100%[1]。遺憾的是，盡管ASFV的疫苗研究已有幾十年的時間，但目前市面上尚無針對ASFV保護性很強的商用疫苗，使得ASFV的防范工作難度進一步加大[2-4]。我國于2018年8月首次向OIE上報了ASFV疫情[5]，且至今仍存在散發疫情。因此，了解ASFV的侵染機制以及疫苗研究進展對于未來控制ASFV疫情具有重要的意義。

1 ASFV浸染細胞方式及胞內轉運

1.1 ASFV浸染細胞方式ASFV進入細胞的過程非常復雜，可以通過多種機制侵染細胞，同時取決于多種因素，包括溫度、膽固醇、能量和pH，以及需要依賴多個細胞因子[6]。ASFV擁有強大的細胞感染能力，當病毒感染復數為50～80時，只需要30 min就可以浸染高達60%的Vero細胞[7]。

前期研究認為，ASFV是通過受體介導的內吞途徑進入細胞，并能短暫寄宿于內吞體。一旦內吞體內環境pH降低到一定程度，ASFV便會穿透內吞體進入細胞質中[8]。隨后研究證實，ASFV進入細胞的內吞途徑主要由網格蛋白介導(clartin mediated)和發動蛋白介導(dynamin mediated)。相較于其他內吞方式而言，網格蛋白介導的吞噬作用是效率最高的胞內外物質交換方式。通過網格蛋白介導的吞噬作用，ASFV可以在幾秒鐘以內進入細胞，并且在1～15 min 就能在內吞體中檢測到ASFV病毒顆粒[9]。發動蛋白是一種GTP酶，其能在細胞內膜的小窩中發生聚集，并通過水解GTP的方式調節自身發生收縮，進而導致細胞膜發生凹陷，最后再剪切質膜并形成吞噬小泡，而胞外物質可以通過凹陷處被吞噬進入細胞。相應地，使用發動蛋白抑制劑能在體外顯著性地限制ASFV對靶細胞的感染[9]。

除了依賴吞噬途徑進入細胞外，ASFV也能通過大胞飲的方式進入細胞。據報道，有一大部分ASFV是通過大胞飲進入到巨噬細胞，且使用大胞飲的抑制劑處理之后能夠顯著性降低ASFV進入巨噬細胞的能力[6,10]。從機制上來講，大胞飲的產生依賴于細胞膜局部的不穩定性，暗示ASFV能夠降低細胞膜局部結構的穩定性，從而通過大胞飲來進入細胞。

值得注意的是，已發表的研究結果多是通過使用內吞抑制劑來研究ASFV侵染細胞的機制，但內吞抑制劑均存在較為嚴重的非特異性的問題，比如氯丙嗪在抑制網格蛋白介導內吞的同時也會對大胞飲產生抑制作用[11]。此外，不同研究者在研究ASFV侵染細胞的機制時所采用的受體細胞也存在差異。因此，目前不能簡單地認為ASFV是依賴于某一種或一類內吞途徑侵染細胞，未來需要采用更新更準確的方法來進行相關研究。

1.2 ASFV 胞內轉運ASFV一旦經過內吞途徑進入細胞后，會沿著內吞途徑寄宿于早期內吞體(early endosome)、晚期內吞體(late endosome)，最后到溶酶體(lysosome)[6]。

CUESTA-GEIJO等[9]發現，ASFV僅需要1～15 min 就能從胞外通過吞噬作用進入Vero細胞的早期內吞體中，并檢測到ASFV的衣殼層關鍵蛋白p72。早期內吞體形成后會隨著內吞途徑進一步形成晚期內吞體，而早期內吞體和晚期內吞體的表面標記有著明顯差異：早期內吞體的表面標記主要是EEA1，而晚期內吞體的表面標記主要是RAB7或CD63。另外，早期內吞體轉化為晚期內吞體的過程中，其囊泡膜上的v-ATPase泵會將胞質中的H+離子泵入囊泡內引起囊泡內環境酸化。早期內吞體轉化為晚期內吞體過程中，隨著內吞體內環境pH的降低，ASFV會發生脫殼效應，此時，在光電子顯微鏡下不能觀察到其二十面體的形態特征，但如果使用抗ASFV核心蛋白的抗體檢測仍然能夠檢測到ASFV[6,12]。進一步研究發現，使用v-ATPase的抑制劑可以顯著抑制ASFV在細胞質中的復制，并且能夠在晚期內吞體中觀察到大量的帶有完整衣殼的ASFV[13]。這一現象也說明，ASFV感染依賴于內吞體內環境的酸化所導致的ASFV脫殼效應。

ASFV發生脫殼效應之后，會將自己的內核膜與內吞體膜融合，釋放核心組分進入細胞質中發生復制。這一個過程是依賴ASFV內膜層上的一個穿膜多肽pE248R蛋白來完成的[6]。此外，研究也發現ASFV會促進整個內吞過程，使內吞體累積在細胞核周圍的ASFV “病毒工廠”附近，利用內吞體內的膽固醇和膜上磷脂酰肌醇(phosphoinositides)為ASFV的膜融合以及ASFV的復制提供原料[14]。最新的研究表明，ASFV感染后還會導致細胞內膽固醇向“病毒工廠”富集，而細胞膜上負責運輸膽固醇脂類轉運體包括羥固醇綁定蛋白(oxysterol-binding protein，OSBP)和膽固醇綁定蛋白(OSBP-related proteins，ORP)介導了該過程。使用OSBP抑制劑伊曲康唑(itraconazole，ITZ)處理細胞后，能夠在不影響OSBP定位的情況下顯著抑制ASFV的復制[15]?？紤]到脂類的轉運可能對ASFV的膜融合和病毒復制起到至關重要的作用，那么阻止“病毒工廠”所需要的脂類轉運可能會極大地限制ASFV感染。據報道，在其他病毒(如丙型肝炎病毒)感染過程中，通過抑制其脂類運輸過程能夠顯著限制其感染[16]。

2 ASFV疫苗的研究現狀

早在1950年就有報道，ASFV感染康復后的豬能夠抵御相同毒力ASFV的感染[17]，意味著ASFV疫苗研發擁有良好的前景，但由于種種原因直到現在都還沒有一個成熟可用的ASFV疫苗。限制ASFV疫苗發展的一個重要因素是ASFV具有強大的免疫逃逸能力，包括先天性免疫和適應性免疫。例如：ASFV的CD2v蛋白能夠抑制淋巴細胞的增殖，促進病毒的感染；A238L基因能夠抑制NF-κB和NEAT的激活，同時抑制一氧化氮的釋放[18]；MGF360和MGF530/505基因能夠抑制Ⅰ型干擾素等一系列炎性因子的釋放，提升感染細胞的存活能力[19]。即便如此，在過去幾十年里，研究者在ASFV疫苗領域仍取得了一定的進展。目前，針對ASFV開發的疫苗類型主要分為3種：滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亞單位疫苗。

2.1 ASFV滅活疫苗滅活疫苗是最常見的疫苗類型，已有多種感染性疾病通過滅活苗得到了有效的控制[20]。但是，滅活疫苗往往對于某些復雜的病毒起不到保護作用。前期有研究通過給豬群免疫經滅活的ASFV感染的巨噬細胞和滅活的ASFV，發現并不能給豬提供有效保護[21]。2014年，BLOME等[22]將滅活的ASFV與不同免疫佐劑混合免疫豬群，發現該滅活疫苗同樣不能給豬群提供有效的保護。從目前看來，ASFV滅活疫苗的方式可能成功率不高。其原因可能是，ASFV在體內感染過程中表達的蛋白譜和體外培養條件下表達的蛋白譜差異很大，滅活疫苗不能產生足夠的保護性抗體。

2.2 ASFV弱毒疫苗弱毒疫苗是通過病毒或細菌在體外或非宿主動物體內的連續傳代制成。弱毒疫苗與滅活疫苗相比，弱毒疫苗能夠持續性誘導機體免疫系統產生保護性抗體。不少研究者也嘗試通過給豬群免疫自然獲得的弱毒ASFV或體外致弱的ASFV，但其效果并不理想，免疫豬群往往出現嚴重的不良反應[23]，原因可能是弱毒疫苗依然是活病毒。此外，研究者發現，通過感染非敏感性細胞(如：Vero細胞)致弱后的ASFV毒株在豬群體內復制的能力顯著性下降，毒力基因的表達也同時下降，導致動物不能產生足夠強的免疫反應[24]。隨著對ASFV病原學的深入研究，鑒定出了越來越多的ASFV毒力相關基因，與此同時，出現了一些基因缺失弱毒疫苗。與傳統的自然選擇或體外選擇弱毒疫苗相比，基因缺失弱毒疫苗是基于ASFV病原學進行的定向突變，其蛋白質組信息更加清晰，安全性與可靠性也更高。已經有一些基因缺失弱毒疫苗在試驗中對豬群起到了較好的保護作用。比如，GALLARDO等[25]報道，缺失了A224L和EP153R基因的NH/P68ΔA224L和NH/P68ΔEP153R弱毒苗能夠保護豬群對同源ASFV毒株的感染；以及缺失MGF360基因的BeninΔMGF弱毒苗免疫豬群后能夠對強毒株產生免疫保護效果[26]。以及近日CHEN等[27]報道，1株缺失了7個基因的弱毒疫苗株HLJ/18-7GD，免疫SPF豬、商品豬以及妊娠母豬后可以產生非常好的保護作用，這可能是一種安全有效的疫苗，有望在控制ASFV傳播方面發揮重要作用。2020年6月10日，農業農村部新聞辦公室發布了哈爾濱獸醫研究所自主研發的1株基因缺失疫苗環境釋放和臨床試驗進展順利的相關消息。該疫苗是于2020年3月獲農業農村部獸用生物制品臨床試驗批件，按照臨床試驗方案，于2020年4月上旬、5月上旬和6月上旬分別在黑龍江、河南和新疆等3個基地啟動疫苗臨床試驗。截止6月底，該疫苗株環境釋放試驗表明疫苗接種仔豬生長狀態良好，無異常臨床狀況；疫苗接種母豬狀態良好，無異常臨床表現，無異常發情、無流產；免疫豬無疫苗毒排放，無水平傳播；免疫后大部分母豬已產仔，免疫組與對照組產仔、死胎率無顯著性差異，仔豬生長狀況良好。總的來說，弱毒疫苗，尤其是基因缺失弱毒疫苗給ASFV的防制帶來了希望。

2.3 ASFV亞單位疫苗亞單位疫苗是通過化學或生物手段，選取細菌或病毒具有免疫保護活性的蛋白或核酸所制成的疫苗，因此被認為是最安全的疫苗類型。ASFV病原學的研究揭示了不少關于ASFV黏附和進入細胞過程中的關鍵蛋白，如p30、p54、pp220、pp62、p72和CD2v等，這些關鍵蛋白均可以作為ASFV亞單位疫苗的候選靶點[28-29]。據報道，利用桿狀病毒表達的p54、p30和p72蛋白作為亞單位疫苗對豬群進行免疫，其產生的中和性抗體能給豬群提供部分保護作用[30-21]。另據報道，通過對豬群免疫p54和p30的融合蛋白，發現其能誘導產生具有保護性的體液免疫[32]。但是，也有報道稱同樣使用桿狀病毒表達ASFV的p22、p30、p54和p72蛋白免疫豬群后，發現并不能提供足夠的免疫保護作用[33]。這看似矛盾的結果可能是因為試驗設計的不同，并不能因此直接否認ASFV亞單位疫苗的價值。

2.4 ASFV基因疫苗CD8陽性T細胞在抗體介導的免疫反應中起到了舉足輕重的作用，所以ASFV的DNA疫苗也成為一個熱門的研究領域。DNA疫苗與亞單位蛋白疫苗不同，DNA疫苗能誘導宿主細胞從細胞內表達病毒蛋白，能直接通過MHC-Ⅰ分子呈遞給CD8陽性T細胞進行識別，從而進一步激活后天免疫流程[34]。LACASTA等[35]通過將ASFV的開放閱讀框(ORFs)文庫和泛素共表達來作為DNA疫苗免疫豬群，發現可以為豬群提供有效的免疫保護，其保護機制可能包括誘導CD8陽性T細胞介導的體液免疫，并且篩選到了多個保護性抗原。鑒于有些蛋白或肽段并不能穩定的誘導保護性抗體的產生，已經有很多研究人員將病毒DNA和蛋白共表達來作為一種新型DNA疫苗。但遺憾的是，將ASFV的DNA(CD2v、p72、p32、±p17)和蛋白(p15、p35、p54、±p17)作為DNA疫苗免疫豬群并不能產生保護性免疫反應[36]。

總之，目前已經發現了超過55個具有免疫原性的ASFV蛋白和44個ASFV新的病毒多肽[37-38]。但是，還不清楚這些蛋白或多肽是否具有完整的免疫保護性。目前，亞單位疫苗研究中，需要找到一個穩定的抗原靶標，同時也需要進一步發現更多具有免疫原性的蛋白。盡管現在亞單位疫苗僅能誘導出部分免疫保護作用，還不能作為真正的疫苗使用，但依賴著它具有高安全性等優點，在該領域的進一步研究是極具意義的。

近年來，重組病毒載體疫苗作為一種新型的基因工程疫苗受到了廣泛的關注。目前，有研究團隊用重組病毒載體表達多個ASFV抗原來免疫豬群，盡管攻毒免疫豬群依然會出現了感染癥狀，但免疫豬群血液和淋巴組織載毒量較正常豬群發生了顯著性下調[38]。在我國，張會雷等[39]將ASFV的結構蛋白p72和p54或CD2v和p30的基因分別插入到痘苗基因組中，構建了同時表達p72和p54的重組痘苗病毒以及同時表達CD2v和p30的重組痘苗病毒，為ASFV重組病毒載體疫苗研發奠定了前期基礎。

3 小結與展望

盡管ASFV現在在我國的流行得到了一定的控制，但想要從根本上控制或清除該病毒還需要很長時間的努力。疫苗作為控制流行病的有效武器，在控制和凈化ASFV的工作中將扮演重要角色。想要制作出保護性良好的疫苗，必然需要病原學的深入研究作為基礎。在疫苗研究方面，亞單位疫苗有著便利性和安全性高等特點，但是目前看來，也許基因缺失的弱毒疫苗更具有應用前景，而滅活苗可能不適用于作為ASFV的疫苗。新型重組病毒載體疫苗為應對ASFV感染提供了新的研究思路，但是從本課題組對以羊痘病毒為載體的重組病毒疫苗的研究現狀來看，受制于病毒的重組效率低以及重組毒株的篩選難度大，重組病毒載體疫苗的研發及應用可能面臨極大的挑戰。