C-Myc在多發性骨髓瘤中的研究進展

楊 寧，鐘 華

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種漿細胞惡性增殖性疾病，其特點為克隆性漿細胞在骨髓中異常增殖。MM發病率在血液系統腫瘤中排第2位，約占血液系統腫瘤的13%[1]。盡管近年來多種新的治療藥物包括蛋白酶體抑制劑、免疫調節藥物和單克隆抑制劑等在臨床上得到了應用，使患者的整體生存狀態得到了明顯改善，但該疾病從本質上講仍屬于不可治愈性疾病。因此，深入探究MM的分子遺傳改變對于MM的早期診斷與提供新的治療靶標具有重要意義。Myc是一種原癌基因，其家族有3個成員，C-Myc、N-Myc和L-Myc，分別位于人染色體8q24、2p24和1p34上[2]。當C-Myc作為轉錄因子時，其又屬于堿性螺旋環螺旋亮氨酸拉鏈（basic helix loop helix leucine zipper，bHLH-Zip）家族，在多數情況下，C-Myc主要通過C端bHLHZIP與同樣含bHLH-ZIP結構的C-Myc關聯因子X（C-Mycassociated factor X，MAX）形成異聚體，C-Myc與MAX異二聚體能特異性識別和結合靶基因DNA序列中的CACGTG核心序列E盒基序（enhancer box，E-Box），調節靶基因轉錄[3]；因此，C-Myc可以調節許多生物學功能，包括影響細胞生長和增殖功能的復制、轉錄和翻譯，以及細胞代謝和凋亡；提示C-Myc可能是癌癥治療的潛在靶標。有相關研究表明，從癌前病變單克隆丙種球蛋白?。╩onoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）發展為冒煙型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM），進而發展為有癥狀的MM，C-Myc的表達增強是上述病程進展的關鍵機制之一[4]。有研究者提出了MM發病機制是免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin heavy chain，IgH）與C-Myc基因共同作用的二次打擊學說。C-Myc的異常高表達不僅被認為是MGUS向MM轉變的信號，也是影響晚期疾病進展的關鍵因素[5]。了解和探究C-Myc在MM發生和發展中的作用，對于探究MM的發病機制及開發新型治療策略具有重要的指導意義。因此，本文將就近幾年來MM中C-Myc的相關研究進展作一綜述。

1 C-Myc基因在腫瘤細胞中的功能

1.1 C-Myc激活DNA復制

C-Myc可以直接調控DNA復制，導致基因組不穩定和DNA損傷。C-Myc可于哺乳動物細胞DNA合成的早期調節DNA復制起點的活性。C-Myc的過表達能導致細胞周期S期的DNA合成位點數量增加，繼而引起活化復制子數量的增加。這可能與腫瘤發生過程中會發生的基因組改變如非整倍性，多中心染色體和染色體斷裂有關[6]。

1.2 C-Myc調控細胞轉錄

已有研究表明，C-Myc編碼的核磷蛋白與MAX結合成異二聚體時可以起轉錄激活劑的作用，但當其與MAX二聚體蛋白（MAX dimerization protein，MXD）家族轉錄因子結合時又轉變為抑制轉錄作用[7]。C-Myc調控轉錄有2種模式：染色質侵犯和選擇性調節。染色質侵犯是指，C-Myc作為基因轉錄的通用放大器，作用于所有活化的基因啟動子和增強子，此時，高表達的C-Myc不會結合和調節特定靶基因的表達，而是會放大細胞內所有基因的轉錄。選擇性調節是指，C-Myc可以直接上調或下調某一個或一類基因的表達[2]。C-Myc調控細胞轉錄具體包括6個方面：（1）C-Myc調節剪接因子。C-Myc可直接調控剪接體組件的轉錄，如核小糖核蛋白顆粒的裝配組件核不均一核糖核蛋白A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNPA1）和hnRNPA2、多聚嘧啶結合蛋白（polypyrimidine tract-binding protein，PTB）和蛋白質精氨酸甲基轉移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）等剪接因子，從而影響細胞轉錄。如丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）在這些剪接因子作用下會產生2個可變剪接的產物，有利于氧化磷酸化的PKM1和有利于有氧糖酵解的PKM2。C-Myc可上調PTB、hnRNPA1和hnRNPA2的轉錄水平，導致PKM的剪接變體PKM2表達水平增高。高PKM2/PKM1比值將有利于有氧糖酵解，這將促進腫瘤的進展[8]。（2）C-Myc激活核糖體合成和蛋白質合成。C-Myc與核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）啟動子中的E-Box元件結合，募集轉錄活化結構域相關蛋白來誘導rRNA的轉錄。C-Myc驅動的腫瘤也依賴蛋白質翻譯活動，真核起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）結合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，EIF4EBP1）通過與eIF4E結合來阻止翻譯起始。在一種C-Myc驅動的轉基因小鼠模型中，C-Myc基因過表達導致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）依賴的EIF4EBP1過度磷酸化，從而失去了與eIF4E結合的活性，并促進了腫瘤的存活[9]。（3）C-Myc調控細胞周期。C-Myc可通過多種機制促進細胞進入S期。大多數細胞周期關鍵調節因子都是由C-Myc調控的基因編碼，這些C-Myc的靶基因包括細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）、細胞周期蛋白和E2F轉錄因子等。細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）可以編碼p21。細胞S期激酶相關蛋白2（S-phase kinase-associated protein 2，Skp2）是一種參與p27降解的蛋白質。C-Myc通過阻斷CDKN1A的轉錄或誘導Skp2的表達來拮抗細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的作用。此外，C-Myc還可以誘導p27降解所必需的枯靈素1（cullin 1，CUL1）的轉錄，從而促進細胞進入S期[10]。（4）C-Myc調控細胞代謝。C-Myc通過調節參與糖酵解和谷氨酰胺代謝的多個基因的轉錄，如葡萄糖膜轉運蛋白1（glucose membrane transporter 1，GLUT1）和丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運載體2（alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2），從而調控細胞代謝[11]。（5）C-Myc參與哺乳動物細胞凋亡。逃避C-Myc基因驅動的細胞凋亡的常見機制是抗細胞凋亡相關因子B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的激活。在擴增或易位而導致C-Myc過度表達的腫瘤中，也有研究報道了Bcl-2基因座的各種重排[12]。有研究顯示骨形態蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可能通過核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路引起C-Myc表達下調，從而使MM細胞凋亡[13]。（6）C-Myc和免疫微環境相互作用。通常情況下腫瘤的發生和發展需要逃避免疫監視。免疫抑制分子的過度表達，如程序性死亡-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）代表了癌癥中免疫逃避的關鍵機制。免疫調節分化簇蛋白47（cluster of differentiation 47，CD47）可 與PD-L1結 合 從而引起細胞凋亡。C-Myc可直接結合這2種免疫檢查點的啟動子以調節腫瘤細胞表面CD47和PD-L1的表達[14]。

2 MM中C-Myc基因過表達的機制

C-Myc過表達在MM的發生和發展中起著關鍵的作用，目前認為MM中C-Myc過表達的機制有以5種：（1）染色體易位。涉及C-Myc異常表達的染色體易位情況在新診斷的MM患者中占20%～50%，這些易位涉及免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）基因位點和一些非Ig融合伴侶基因，如46序列相似的家庭成員C（family with sequence similarity 46，member C，FAM46C）、叉頭轉錄因子O亞型3（forkhead box O3，FOXO3）和骨形態發生蛋白6（bone morphogenetic protein 6，BMP6）。融合基因是指將2個或多個基因的編碼區首尾相連，置于同一套調控序列（包括啟動子、增強子、核糖體結合序列和終止子等）控制之下，構成的嵌合基因，參與融合的基因稱為融合伴侶基因。在這種情況下，在融合伴侶基因的增強子或超級增強子的作用下，C-Myc基因啟動子的活性增強從而引起C-Myc過表達[15]。（2）染色體8q24.21位點重復。在15%的新診斷MM患者中存在8q24.21位點重復和C-Myc基因擴增，其中38%的患者還存在C-Myc基因的易位，62%的患者僅存在局灶性染色體增加[16]。（3）大鼠肉瘤病毒癌（ratsarcoma viral oncogene，RAS）基 因 突 變。N-RAS和K-RAS是MM中2種最常見的突變基因，RAS信號通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）使C-Myc第62位絲氨酸（Ser62）磷酸化，Ser62磷酸化可以增強C-Myc的穩定性?；虮磉_分析的結果表明，幾乎所有發生RAS基因突變的MM患者均存在C-Myc基因高表達的特征。大多數情況下，在RAS基因突變的患者中未發現IgH易位，這表明RAS基因突變可能直接參與了C-Myc的激活[17]。（4）C-Myc與干擾素調節因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）的反饋調控。IRF4是MM中反復突變的基因之一，IRF4可直接結合C-Myc啟動子區域，增加C-Myc的表達。在MM細胞中，IRF4與C-Myc形成正反饋通路，從而進一步增加C-Myc的表達[18]。（5）果蠅3號姐妹染色單體分離缺陷突變3（defective in sister chromatid disjoining 3，DIS3）基 因/LIN-28同源 基 因B（LIN-28 homolog B，LIN28B）/微RNA（microRNA，miRNA）let-7/C-Myc信 號轉導軸。DIS3因最早在果蠅中發現而得名，其編碼的蛋白DIS3亞基是保守的RNA核酸酶及外泌體的催化亞基，屬于RNaseⅡ3’-5’核酸外切酶超家族，其能夠對所有的RNA進行加工或者促使其降解。該蛋白氨基端含有PIN結構域，賦予DIS3核酸內切酶活性，羧基端具有RNB結構域，賦予其3’-5’核酸外切酶活性。LIN28B編碼的蛋白是一種RNA結合蛋白，可調節miRNA let-7的表達。LIN28B蛋白與let-7的5’-非編碼區結合，激活RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），從而抑制C-Myc的表達。DIS3失活會增加LIN28B的表達，抑制let-7的表達，從而導致C-Myc的過度表達[19]。

3 C-Myc基因過表達與MM發生和發展的相關性

已有大量臨床數據顯示，MGUS是MM的癌前病變，幾乎所有的MM患者都經歷了從癌前病變MGUS到MM的過程，MGUS患者中每年有1%進展為MM患者[20]。因此，探究MGUS到MM這一過程中的分子驅動因素對于MM的預防和治療都顯得尤為重要。在一種C-Myc驅動的MM轉基因小鼠模型中，首先證實了C-Myc基因在MGUS向MM發展的過程中發揮的驅動作用[21]。此外，基因集富集分析顯示了C-Myc在MM中表達增強，而在MGUS中幾乎不表達，由此提示MYC高表達是導致MM疾病進展的中心事件之一。CHNG等[22]采用基因富集分析比較了Affymetrix U133平臺上22例MGUS和101例MM患者的基因表達數據集，發現C-Myc在67%的MM中高表達，但在MGUS中沒有高表達。同時又對48例MM（新診斷36例和復發12例）骨髓樣本和8例MGUS骨髓樣本采用免疫組織化學法檢測漿細胞表面蛋白CD138和細胞核中C-Myc蛋白的表達水平，結果顯示在MGUS樣本中未檢測到C-Myc高表達，但在60%的MM樣本中檢測到C-Myc高表達。XIAO等[23]通過對26例MM骨髓樣本和29例MGUS骨髓樣本進行免疫組織化學檢測，結果發現84%的MM樣本中有C-Myc表達，而MGUS的樣本中沒有一例有C-Myc表達。在一項涉及23例患者的研究中概述了骨髓瘤的克隆進化過程及存在的細胞遺傳學異常，結果發現23例患者中有12例出現或進展為漿細胞白血?。╬lasma cell leukemia，PCL）和（或）髓外疾?。╡xtramedullary disease，EMD）。所有患者中位總生存（overall survival，OS）期為20.2個月，PCL或EMD患者的OS期分別為15.5和40.4個月，均有明顯縮短（P＝0.000 5）；由此提示，任何類型的Myc基因高表達對于MM患者的生存都是不利的，即使是Myc基因低倍數擴增的MM患者，其腫瘤也趨于晚期且預后不良。C-Myc的過度表達也與更具侵襲性的MM相關，如PCL和EMD[24]。有研究提示，繼發性PCL是終末期MM的白血病轉化，這可能與Myc的過度表達有關[25]。大量的臨床研究表明，C-Myc高表達意味著MM的進展和（或）預后不良。XIAO等[23]發現，在接受蛋白酶體抑制劑硼替佐米和SCT治療的MM患者中，通過11個月的中位隨訪期發現，中高表達與低表達C-Myc基因的患者之間，24個月無進展生存（progressionfree survival，PFS）期率分別為40%與86%，24個月OS率分別為63%與100%，這表明C-Myc基因的表達水平與以硼替佐米為主的MM臨床治療反應性之間呈負相關。SZABO等[26]對117例MM患者的回顧性研究中發現，在40%的患者中C-Myc呈過表達，C-Myc的過表達與高鈣血癥（P＝0.02）和EMD（P＜0.01）有關，也與較短的OS期相關[風險比（hazard ratio，HR）＝1.92，P＝0.03]。在一項對214例SMM骨髓樣本的全外顯子測序中發現，C-Myc基因畸變（易位或擴增）的患者中位進展時間（time to progression，TTP）最短（8.4～51.6個月，P＜0.001），診斷時C-Myc基因畸變與較高的骨髓浸潤相關（P＜0.001）并且C-Myc基因是進展的獨立風險預測因子[27]。M?LLER等[28]對194例未經治療的新診斷的MM骨髓樣本采用免疫組織化學法同時檢測CD138和C-Myc蛋白的表達情況；研究結果顯示，C-Myc蛋白陽性表達率≥40%（C-MycHigh）患者的平均OS期為11個月，而C-Myc蛋白陽性表達率＜40%（C-MycLow）患者的中位生存期為48個月（P＜0.01）。C-MycHigh與國際分期系統（revised international staging system，R-ISS）、高增殖指數、骨髓中漿細胞比例、成漿細胞形態、高血鈣水平和異常核型均顯著相關。C-MycHigh是影響OS的獨立風險因子（HR＝2.5）。

4 MM中C-Myc基因相關治療靶點的研究進展

目前，在MM治療中，已經開發出了有幾種直接或者間接靶向C-Myc的新治療方法，其中一些治療措施已經開始在臨床試驗中進行評估。

4.1 靶向抑制C-Myc基因的轉錄

具體有以下幾種方法：（1）通過siRNA靶向抑制C-Myc基因的表達。DCR（dynamic contrast ratio，Dicer，又 稱DCR）是RNAaseⅢ家族中的一員，其主要切割dsRNA或者莖環結構的RNA前體，形成siRNA；切割產生的siRNA片斷解開變成單鏈與體內某些蛋白質形成RISC。RISC能結合到細胞內與siRNA互補的mRNA上，并切割該mRNA，使其被降解，造成蛋白質無法合成，繼而產生基因“沉默”現象。通過包裹在脂質納米顆粒中靶向C-Myc基因的siRNA，可以實現對C-Myc基因表達的直接抑制。這種脂質納米顆粒被稱為DCR-C-Myc，可以抑制C-Myc基因的翻譯和表達[29]。一項Ⅰ期臨床試驗（NCT02110563）正在評估DCRC-Myc對實體瘤、MM或淋巴瘤患者的安全性和耐受性，相關結果還未進行報道。（2）靶向抑制C-Myc-MAX結合。目前研發出的小分子抑制劑10058-F4或10074-G5，在體外實驗中顯示出具有抑制C-Myc與MAX形成異二聚體的活性。然而，這些分子在體內的快速降解和較差的體內分布阻礙了其進一步發揮應有的作用[30]。抑制C-Myc與MAX結合的新分子Mycro3在小鼠胰腺導管腺癌模型上顯示出較好的治療作用，在MM中的作用還需要進一步的驗證。因此Mycro3也是C-Myc基因驅動的MM的潛在用藥[31]。（3）免疫調節藥物。在過去20年中，免疫調節藥物沙利度胺和來那度胺等的應用顯著改善了MM患者的預后。Ikaros家族鋅指蛋白1（Ikaros family zinc finger proteins 1，IKZF1）和Ikaros家 族鋅指蛋白3（Ikaros family zinc finger proteins 3，IKZF3）是B細胞分化過程中轉錄調控網絡必不可少的的轉錄因子，來那度胺通過誘導蛋白酶體中IKZF3的泛素化降解，降低了IRF4的表達，參與到C-Myc的正反饋回路，從而降低C-Myc的表達[32]。（4）靶向抑制剪接體功能。C-Myc基因驅動的腫瘤細胞具有核心剪接體依賴性。在一項對C-Myc基因驅動的三陰性乳腺癌的全基因組測序中，鑒定出了SF3B1、U2AF1、SNRPF、EFTUD2和BUD31等5個剪接體成分，研究中發現在體內擾亂剪接體的功能可以殺死小鼠模型中的腫瘤細胞，同時并不影響正常細胞。敲低BUD31或SF3B1，或使用SF3B1的抑制劑SD6分子，可以減少乳腺癌原發腫瘤的腫瘤細胞數量，并且抑制異種移植瘤的形成[33]。這些結果表明，靶向剪接體干預為C-Myc驅動癌癥的治療提供了機會。（5）溴結構域蛋白質抑制劑。人類溴結構域蛋白質家族的溴結構域蛋白2（bromodomain containing protein 2，BRD2）、溴結構域蛋白3（bromodomain containing protein 3，BRD3）、溴結構域蛋白4（bromodomain containing protein 4，BRD4）的溴結構域和末端結構域（bromodomain and extraterminal，BET）能識別乙酰化賴氨酸殘基的蛋白結構域，這種識別是一些調節蛋白和組蛋白的結合以及染色質結構重塑的先決條件。如BET能識別組蛋白拖尾上N末端的賴氨酸殘基，從而導致染色質結構的變化，調節靶基因的表達。BRDs在超級增強子中募集轉錄中介體亞基1（mediator subunit 1，MED1），并通過與正性轉錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）和RNA聚合酶Ⅱ的相互作用促進基因轉錄。C-Myc基因本身的轉錄也受BET溴結構域的調控。針對BRD的同類最優小分子抑制劑OTX015已經在編號為NCT01713582的Ⅰ期臨床試驗中確定了淋巴瘤和MM患者的最大耐受劑量[34]。在編號為NCT02157636包括復發性MM在內的Ⅰ期臨床試驗中，小分子抑制劑CPI-0610顯示出了潛在的臨床前活性[35]。

4.2 抑制C-Myc基因的翻譯

C-Myc基因的翻譯高度依賴真核翻譯起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F）。eIF4F復合物由eIF4E、eIF4A和eIF4G亞基組成，其中eIF4E可被eIF4E結合蛋白（eIF4E binding protein 1，4E-BP1）結合，而阻止翻譯起始。由mTOR信號轉導的4E-BP1的過度磷酸化導致eIF4E被4E-BP1釋放，使eIF4F復合物形成，進而C-Myc基因翻譯開始。C-Myc基因本身也可激活eIF4E的表達，構成反饋回路。當mTOR信號被磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）激活時可抑制C-Myc的翻譯。磷酸肌醇3-激酶δ（phosphoinositide 3-kinase delta，P13Kδ）是丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）的一種亞型，主要存在于免疫細胞和血液細胞中。研究表明，新型PI3Kδ同種抑制劑TGR-1202可破壞4E-BP1-eIF4F-MYC軸，從而對B細胞和T細胞淋巴瘤、白血病、MM的細胞系和原代細胞具有抗腫瘤作用[36]。一項復發或難治性淋巴瘤患者的Ⅰ/Ⅱ期研究（NCT02867618）正在評估TGR-1202和卡非佐米的聯合用藥效果。

4.3 抑制C-Myc基因與腫瘤免疫微環境的相互作用

C-Myc基因可直接結合CD47和PD-L1基因啟動子調節細胞表面CD47和PD-L1的表達，從而利于腫瘤生長。免疫檢查點抑制劑可能成為治療MM的新靶點。NCT02678338、NCT02953782、NCT02216409和NCT02953509等臨床試驗正在評估抗PD-L1的單克隆抗體atezolizumab和durvalumab的治療效果[37]。此外，探究PD-L1抑制劑與其他藥物的聯合使用也是目前MM治療的熱點。有研究報道，在復發難治性多發性骨髓瘤（relapsed and refractory multiple myeloma，RRMM）患者中，接受抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death 1，PD-1）的單克隆抗體pembrolizumab＋來那度胺或泊馬度胺＋地塞米松治療后，總緩解率（overall response rate，ORR）約為50%～60%，但這種聯合用藥的安全性問題尚待解決[38]。

5 總結與展望

C-Myc作為MM發生和發展過程中起重要作用的原癌基因，應受到足夠的重視。盡管大量基礎研究已經證實了其在調節多種細胞生物功能中所發揮的作用，但目前對C-Myc基因驅動MGUS向MM的進展機制及針對C-Myc基因所進行的相關靶向治療仍處在起步階段。深入探究其結構、作用機制和對在MM發生和發展過程中發揮的具體作用，研究和開發以此為靶點的新型靶向藥物將對MM的發病機制、早期檢測和疾病預后具有重要意義。