基于網絡藥理學探討野生砂生槐生物活性機制

趙年壽，紀 鵬*，魏彥明，武凡琳，拉巴次旦，吳金措姆，馬興斌，華永麗，姚萬玲

(1.甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070；2.西藏自治區農科院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009)

砂生槐(Sophoramoorcroftiana, SM)在西藏又被稱之為“狼牙刺”和“藏薊”，豆科槐屬植物，多年生矮灌木，為該地區重要野生植物資源之一。砂生槐提取物具有良好的抗寄生蟲、抗病毒、抗腫瘤、抑菌等藥理活性[1]，但目前對其化學成分的生物功效物質基礎、作用靶點及效用機制的相關研究尚不明確，因此有必要對其化學成分的作用機制進行探討和研究。

網絡藥理學作為一門融入多學科的交叉學科，涉及多種學科，如系統生物學、高通量篩選和網絡分析技術等[2]，與中醫藥的整體性和系統性相一致，能對多成分、多靶點、多通路進行整合，適用于藥物潛在生物活性的研究[3-5]，有助于臨床靶向藥物的篩選及研究。因此，本研究就基于成分-靶點-通路的網絡藥理學探討野生植物砂生槐的藥用物質基礎、作用靶點及生物活性作用機制，為野生砂生槐藥用價值的深入開發奠定良好基礎。

1 方 法

1.1 軟件與數據庫

PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)；Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/uniport)；STRING數據庫(https://string-db.org/)；DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape 3.7.0軟件；ChemDraw 17.1.0軟件；R 3.6.3軟件。

1.2 砂生槐化學成分收集

CNKI數據庫中檢索與“砂生槐”相關的關鍵詞，從文獻中篩選出經核磁共振和質譜等分析手段確認的化學成分，獲取的化學成分結構在ChemDraw 17.1.0軟件Search選項Find structure from name at ChemACX.Com中獲取，并在PubChem數據庫中對獲取的結構式進行確認。

1.3 砂生槐化學成分潛在靶點預測及基因名標注

利用PubChem數據庫獲取砂生槐化學成分的3D結構，以SDF格式保存，將SDF文件導入Pharm Mapper數據庫，以“Druggable Pharmacophore Models”作為靶點，進行化學成分藥效團潛在靶點預測，預測結果以Normalized Fit Score>0.6進行篩選，Uniprot數據庫進行UniProt ID的校正和轉化。

1.4 砂生槐化學成分靶點蛋白PPI網絡構建

將篩選的化學成分靶點輸入到STRING數據庫，將最低交互分數設置為0.4，構建成分靶點蛋白互作網絡，獲取的結果以TSV格式保存。

1.5 構建砂生槐化學成分-靶點網絡

PPI靶點網絡中將靶點和化學成分作為“節點””，Cytoscape 3.7.0軟件構建化學成分與靶點、靶點間的互作網絡，從網絡中篩選出節點值較高的核心靶點和有效化學成分。

1.6 GO、KEGG富集分析

為進一步說明砂生槐化學成分的靶點是如何通過通路來發揮作用，將砂生槐的化學成分靶點輸入DAVID數據庫中，Select Identifier設置為OFFICIAL GENE SYMBOL，進行GO生物學過程(Biological process, BP)、細胞組分(Cell component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)及KEGG通路分析，最后采用R 3.6.3軟件構建GO和KEGG富集的可視化網絡圖。

2 結 果

2.1 砂生槐化學成分的獲取

通過文獻檢索，共搜集到砂生槐化學成分18種[6-7]，其化學成分主要包含生物堿類、黃酮類、酯類、甾體類等，這些化學成分均經過核磁共振和質譜等分析，具體化學成分及結構式如表1所示。

表1 砂生槐化學成分及結構

2.2 砂生槐化學成分潛在靶點預測及基因名標注

以Normalized Fit Score>0.6篩選PharmMapper數據庫中的靶點，刪除重復并去除假陽性，共獲得518個靶點，靶點頻率較高的有dhp1、ung、dhaK、bglIIR、CDC33等，部分靶點如表2所示。

表2 部分藥效團模型靶蛋白及基因名標注

2.3 構建砂生槐成分靶點蛋白互作網絡

砂生槐有效活性化學成分中的蛋白互作網絡共包含240個節點，577條邊，平均節點度值為4.81，平均局部聚類系數為0.355，PPI豐富p值為1.12×10-8，如圖1所示，網絡的節點代表靶點，節點與節點之間的邊代表蛋白與蛋白的相互作用，不同的顏色代表不同的相互作用，其中度值越大代表在網絡中的作用越大。利用R語言對PPI分析結果中的基因節點數目進行排列，排列結果如圖2所示，核心靶點主要有EGF、CREBBP、ERBB2、MDM2、RAC1等。

圖1 蛋白互作網絡圖

圖2 核心靶點基因條形圖

2.4 砂生槐化學成分-靶點網絡

Cytoscape 3.7.0 軟件構建砂生槐化學成分-靶點網絡，從18種化學成分中共篩選出15種有效化學成分，網絡中的節點值(Degree)越大就表明在網絡調控中越重要。有效化學成分中的節點值如表3所示，以β-谷甾醇、羽扇醇和貓尾草異黃酮的節點值最高；靶點基因中的節點值如表4所示，涉及重要的靶點有MDM2、ERBB2、AR、MTOR、F2、TJP1、NOTCH1等，圖3為化學成分靶點和靶點互作網絡圖，左邊代表化學成分，右邊代表靶點。

圖3 砂生槐活性成分和靶點網絡

表3 砂生槐有效化學成分節點值

表4 砂生槐有效化學成分靶點基因節點值

2.5 GO分析

DAVID數據庫中共富集到GO條目168個，其中94個條目為生物學功能(BP)，28個條目為細胞組分功能(CC)，46個條目為分子功能(MF)，分別占總條目的56%，17%和27%；功能富集分析結果如圖4～6所示。BP主要涉及低氧反應(Response to hypoxia)，細胞運動的調節(Regulation of cell motility)；CC主要涉及胞漿(Cytosol)，胞外體(Extracellular exosome)；MF主要涉及蛋白結合(Protein binding)。

圖4 GO生物學功能富集分析柱狀圖

圖5 GO細胞組分功能富集分析柱狀圖

圖6 GO分子功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG分析

KEGG通路共富集到15條信號通路，通路分析結果如圖7所示，分析結果顯示主要涉及的通路為膀胱癌通路(Bladder cancer)、前列腺癌通路(Prostate cancer)、肌動蛋白細胞骨架的調控通路(Regulation of actin cytoskeleton)、神經膠質瘤通路(Glioma)及cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)，KEGG富集通路及靶點基因如表5所示。

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

表5 KEGG通路富集及靶點基因

3 討 論

通過構建砂生槐化學成分-靶點的可視化網絡圖，從18種化學成分中共篩選出15種有效成分，節點值較高的有效成分為甾醇類β-谷甾醇(degree=54)、三萜烯類羽扇醇(degree=49)、黃酮類貓尾草異黃酮(degree=47)、脂肪酸類亞油酸(degree=33)。有研究結果表明，β-谷甾醇不僅能對多種腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，而且還能誘導多種腫瘤細胞發生凋亡，具有降血脂、抗炎、調節免疫等功能[8-10]；貓尾草異黃酮能對乳頭狀甲狀腺癌產生抑制作用，并對多種實體瘤具有廣泛的抗癌活性[11]；亞油酸對結腸癌細胞(SW480)有促生長作用[12]。活性成分-靶點的互作網絡中涉及的重要靶點有MDM2(degree=19)、ERBB2(degree=18)、AR(degree=18)、MTOR(degree=17)。有研究結果表明，MDM2 T309G突變可降低前列腺癌風險，通過對該基因多態性進行監測，有助于前列腺癌的早期診斷、治療和預后[13-14]；在多種癌癥類型中，酪氨酸激酶受體ERBB2常被過度表達，那拉替尼對ERBB2泛素化介導的胞內降解可顯著抑制卵巢癌細胞生長[15]，且ERBB2的插入突變可導致乳腺癌細胞的加速生長[16]。該結果與本研究篩選到的結果相符合，進一步表明砂生槐發揮藥理活性是其多個化學成分與多個靶點基因的相互作用。

GO富集結果表明，生物過程的94個條目中主要為低氧反應、細胞運動調節，分子功能的28個條目中主要為蛋白結合，細胞組分的46個條目中主要為胞漿、胞外體，該部分的分析結果表明，砂生槐中的化學成分可能通過對節點值較高的MDM2、ERBB2、AR、MTOR靶點進行調控，從而影響胞漿和胞外體的細胞學組分來調節蛋白質合成作用，進而影響疾病的產生與發展。在15條KEGG富集通路中，4條通路涉及癌通路、3條涉及代謝通路及cAMP、FoxO 2條信號通路。靶點MDM2、ERBB2、MTOR在多條富集通路中多次出現，進一步提示砂生槐中的化學成分物質可能通過與關鍵靶點的相互作用從而對癌癥、代謝等疾病的產生和凋亡進行調控。cAMP信號通路作為發揮重要功能作用的第二信使，在動物中介導激素效應，參與基因表達、細胞增殖等[17]；FoxO信號通路在腫瘤抑制、細胞損傷代謝調節和免疫等方面發揮著重要作用[18]。因此，可推測MDM2、ERBB2、MTOR靶點與cAMP、FoxO信號通路的共同互作是砂生槐發揮多種生物活性的最主要原因。

綜上所述，本研究首次借助網絡藥理學的方法探討并獲取了砂生槐化學成分的主要活性成分、關鍵靶點及涉及的生物通路，初步揭示了砂生槐中的多成分、多靶點協同作用的特點。通過該方法，一方面證實了砂生槐已有成分的生物活性作用研究，另一方面發現砂生槐通過調控節點值較高的靶點及其它基因，從而對代謝類疾病、神經性等多種疾病達到治療和預防的效果。本研究結果期望能為后期癌癥類、代謝類、神經系統類疾病的治療及野生砂生槐作為藥用資源的開發和利用奠定基礎。