雪靈芝粗多糖對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響

王 剛，連紫宛，李占強，張朝霞，樊 融，馬 蕊

(1.青海衛生職業技術學院 醫學基礎教育研究中心，青海 西寧 810000；2.衢州市人民醫院 病理科，浙江 衢州 324000；3.青海大學 高原醫學研究中心，青海 西寧810000)

雪靈芝(ArenariakansuensisMaxim)是廣泛分布于青藏高原的石竹科蚤綴屬野生植物，藏藥名謂“阿仲”。研究顯示，其成分主要含有多糖、黃酮、三萜皂苷及生物堿，具有免疫調節、抗氧化及抗炎等生物學效應[1-3]。本課題組前期研究顯示，雪靈芝粗多糖(Crude polysaccharide fromArenariakansuensisMaxim, AKCP)具有促進小鼠脾淋巴細胞增殖、NK細胞殺傷及巨噬細胞吞噬活性[4-5]；對環磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能發揮保護作用[6]；對S180荷瘤小鼠的瘤體生長，顯現出抑制效應[7]。基于上述研究結果，本研究進一步探討AKCP對S180荷瘤小鼠的免疫功能，是否具有激活作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

30日齡SPF級Balb/c小鼠，雌雄各半，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(陜)2018-001；S180及Yac-1細胞購于中科院上海細胞庫；雪靈芝全草購自青海九康醫藥保健品有限公司，并參照文獻[4-5]按以下方法提取AKCP：雪靈芝全草粉碎后，加入40倍體積水并以95℃浸提，提取液經乙醇沉淀后，采用Sevage法除蛋白，收集脫蛋白后的水相流水透析去除小分子雜質，以3倍體積乙醇沉淀后冷凍干燥，得到雪靈芝粗多糖(AKCP)粉劑。香菇多糖注射劑(LNT)購自南京易亨制藥有限公司。ELISA試劑盒(IL-2、TNF-α、IFN-γ)以及熒光標記單抗(CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP)均購自達科為生物技術有限公司。xMark-10483酶標儀(Bio-red公司)，LightCycler 96PCR儀(Roche公司)，CytoFLEX流式細胞儀(BECKMAN公司)。

1.2 S180荷瘤小鼠模型建立

取0.2 mL體外培養的S180細胞(5×106cells/mL)注射于小鼠腹腔，1周后抽取腹水，離心沉淀細胞后，以生理鹽水洗滌并調整細胞濃度至1×106cells/mL，按每只0.2 mL接種于Balb/c小鼠右前肢腋窩皮下。

1.3 試驗分組與處理

小鼠隨機分為正常組、模型組、香菇多糖(LNT)組、AKCP高(-H)、中(-M)、低(-L)劑量組；除正常組外，其余5組按1.2方法建立S180荷瘤小鼠模型。于建模后第2日開始，正常組和模型組小鼠每日給予0.5 mL蒸餾水灌胃；香菇多糖組小鼠每日按0.25 mg/kg劑量腹腔注射LNT；AKCP高、中、低劑量組，每日各給與200、100、50 mg/kg劑量的AKCP水溶液灌胃；經上述處理8天，將各組小鼠進行稱重后斷頭處死，隨后無菌條件下切取瘤體、脾臟和胸腺并進行稱重。按參考文獻[4, 6]，制備小鼠脾細胞懸液。

1.4 體重增率、抑瘤率和免疫臟器系數計算公式

體重增率=(處死前體重-初始體重-瘤重)/初始體重×100%；抑瘤率=(模型組平均瘤重-藥物處理組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%；脾臟系數=脾重(mg)/體重(g)；胸腺系數=胸腺重(mg)/體重(g)。

1.5 脾淋巴細胞增殖與NK細胞殺傷活性檢測

采用MTT法檢測脾淋巴細胞增殖和NK細胞殺傷活性。脾淋巴細胞增殖活性以刺激指數(SI)表示：SI=ConA刺激孔A值/對照空A值；NK細胞殺傷活性=[1-(效-靶細胞孔A值-效應細胞孔A值)/靶細胞孔A值]×100%。

1.6 脾細胞中T細胞亞群檢測

取1×106cells/mL濃度的小鼠脾細胞懸液100μL加入流式檢測管，各管中加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP單抗后，避光孵育30 min，經PBS洗滌細胞后進行流式細胞術檢測。采用CytExpert軟件分析CD3+/CD4+/CD8+T細胞亞群及CD4+/CD8+比值。

1.7 脾細胞中細胞因子的mRNA表達

離心沉淀小鼠脾細胞，Trizol法抽提總RNA。以GAPDH為內參基因，按試劑盒說明書操作，進行反轉錄合成cDNA和熒光定量q-PCR檢測細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達。

1.8 ELISA法檢測血清中細胞因子

按ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中細胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 AKCP對S-180荷瘤小鼠瘤體生長的抑制作用

結果顯示，LNT和AKCP-H組抑制瘤體生長的作用較為明顯(P<0.05)(見圖1，表1)。

圖1 各組荷瘤小鼠瘤體圖

表1 各組荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率

2.2 各組小鼠體重增率及免疫臟器系數的比較

結果顯示，AKCP-H組的體重增率較正常組和模型組降低(P<0.05)；各組間胸腺及脾臟的臟器系數無顯著性差異(見表2)。

表2 各組小鼠體重增率及免疫臟器系數

2.3 各組小鼠脾淋巴細胞增殖及NK細胞殺傷活性的比較

MTT檢測結果顯示，模型組脾淋巴細胞增殖指數(SI)低于正常組，LNT組、AKCP-H、AKCP-L組SI較模型組升高(P<0.05)；且NK細胞殺傷活性在各組間的變化也與之基本相同(P<0.05)(見表3)。

表3 MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖及NK細胞殺傷活性

2.4 各組小鼠脾淋巴細胞亞群的比較

與正常組比較，模型組CD3+T細胞、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+亞群下降；模型組和LNT組CD4+/CD8+比值升高。各AKCP劑量組CD3+/CD8+T細胞亞群較模型組顯著升高，且CD4+/CD8+的比值明顯降低(P<0.05)(見表4)。

表4 流式細胞術檢測小鼠脾淋巴細胞亞群

2.5 各組小鼠脾細胞中IL-2、IFN-γ及TNF-α的mRNA表達

經熒光定量PCR法檢測各組小鼠脾淋巴細胞中細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的mRNA相對表達量，LNT組、AKCP-H組IFN-γ mRNA表達水平高于正常組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組小鼠脾細胞中IL-2、IFN-γ及TNF-α mRNA表達

2.6 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ及TNF-α水平

經ELISA檢測結果顯示，建立荷瘤模型的各組小鼠血清中TNF-α水平均較正常組升高(P<0.05)；AKCP-M、AKCP-L組小鼠血清中IL-2水平高于模型組(P<0.05)；正常組、LNT組及AKCP-L組小鼠血清中IFN-γ水平高于模型組(P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ及TNF-α水平

3 結論與討論

多糖是一類由多個單糖脫水縮合形成的天然高分子物質。近年來的研究表明，來源于自然界植物、菌類的多糖類物質具有多種生物學活性，如抗腫瘤、抗氧化及免疫調節等，其中免疫調節作為其主要的生物活性，受到廣泛學者關注[8-11]。本課題組之前的體外和體內研究表明，AKCP對正常小鼠來源的免疫細胞、免疫抑制模型小鼠，表現出免疫激活及免疫保護活性。基于此，本研究以S180荷瘤小鼠為模型，進一步觀察在腫瘤存在的情況下，AKCP對機體抗腫瘤免疫功能的影響。

首先，免疫細胞、細胞因子活化狀態，對機體抗腫瘤具有重要意義[12-14]。在免疫細胞方面，本研究結果顯示，AKCP-H組與LNT組對于S180荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖水平和NK細胞殺傷活性的下降具有明顯的恢復作用。T細胞亞群分析結果顯示，與正常對照組比較，S180荷瘤模型組小鼠脾細胞中CD3+T細胞明顯減少，相應地CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T細胞亞群均明顯減少，并且出現CD4+/CD8+比例明顯升高的現象。本研究采用的陽性對照LNT注射劑，是目前臨床常用的抗腫瘤輔助藥物[15-16]，具有較為確定的免疫激活作用。LNT組與AKCP組存在給藥方式、劑量不同，因而LNT的對照作用，在于免疫激活效應的定性分析的參照意義，而不具有定量分析的參照意義。結果顯示，LNT組和各AKCP組顯示出對CD3+/CD4+亞群的升高趨勢。但是，LNT組對CD3+/CD8+亞群無升高作用，其CD4+/CD8+比例與模型組一樣高于正常對照組。而與LNT組不同的是，本研究中各AKCP處理組CD4+/CD8+比例較模型組明顯下降，并恢復到與正常對照組相近的水平。此結果提示，AKCP和LNT作為兩種不同來源的天然多糖，二者雖然均對機體發揮抗腫瘤免疫的主要細胞群體-淋巴細胞的增殖均有促進效應，但是二者對T細胞的亞群分化具有不同的調節作用，AKCP能夠使CD3+/CD8+T亞群明顯升高，可能更有利于機體產生更多的殺傷性T細胞(CTL)，從而在CD4+T協同下發揮更加顯著的腫瘤殺傷作用。在細胞因子方面，AKCP-M、AKCP-L組與LNT組可提高IL-2和IFN-γ的mRNA表達和血清中的水平；而對S180荷瘤模型引起的TNF-α的mRNA表達和血清水平升高沒有顯著影響；提示AKCP與LNT具有相同的激活Th1型細胞因子表達的作用。

其二，在抑瘤效應方面，AKCP與LNT對S180實體瘤的生長均顯示出抑制作用，其中AKCP-H組抑瘤率達到36.64%。結合本研究組之前報道[7]，AKCP對S180荷瘤小鼠瘤組織中細胞增殖相關因子CyclinD1、PCNA和Ki67，以及對細胞凋亡相關因子Bax、Bcl-2的 mRNA和蛋白表達水平，均無明顯影響。本研究認為AKCP雪靈芝多糖表現出的對荷瘤小鼠的瘤體抑制效應，其主要機制并非是通過影響瘤細胞增殖和凋亡而發揮直接性抑瘤作用，而是通過激活機體抗腫瘤免疫，進而發揮間接性抑瘤作用而實現的。

此外，S180荷瘤模型組小鼠體重增率與正常對照組接近，而AKCP各劑量組及LNT組體重增率出現下降，其中以抑瘤率最高的AKCP高劑量組尤為明顯，提示在荷瘤小鼠體內抗免疫功能被激活和發揮抗腫瘤作用的過程中，機體的能量和營養物質代謝可能也相應發生了改變，有待進一步研究。