阿納其根總黃酮提取工藝及其對Tau蛋白過度磷酸化的研究

高 莉，孫云鵬，霍仕霞，阿娜爾·馬木提，買買提·艾力，閆 明

(新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆維吾爾自治區維吾爾醫方劑學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

阿納其根是羅馬除蟲菊Anacycluspyrethrum(L.)DC.(AP)的根，干熱、味辛辣而麻舌，具有祛寒強筋、開通阻滯、通利經水、滋補神經等功效[1-2]，主要用于治療白癜風、腫瘤、膝骨關節炎等疾病[2-4]，主要分布于北非和歐洲南部，我國新疆有少量的野生資源分布。阿納其根主要含有黃酮類、揮發油類、N-烷基類、香豆素類等化學成分[5]，黃酮類被認為是其主要活性成分之一，具有抑制腫瘤細胞增殖[3]、酪氨酸酶激活[6]、保護神經細胞[7]和調節情緒[8]等功效。目前，阿納其根的研究報道主要為對其化學成分分析和藥效作用的評價方面，而對于其總黃酮類成分提取及作用機制方面報道甚少。

響應面設計法是可靠的實驗設計及分析方法，可通過過程的回歸擬合計算出響應于各因素水平的響應值，在提取試驗中往往能夠得到最優工藝參數，是解決多變量問題的一種有效統計方法[9-10]。本研究根據單因素試驗的結果，采用響應面法進一步優化乙醇提取阿納其根總黃酮的提取工藝，同時，基于前期研究發現的其具有改善岡田酸(okadaic acid，OA)對PC12細胞損傷的作用基礎上[7]，探討阿納其根總黃酮是否通過抑制Tau蛋白過度磷酸化作用起到細胞保護作用，為阿納其根進行更深入的研發和應用提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

蘆丁標準品(純度>99%，上海源葉生物科技有限公司)；阿納其根(新疆麥迪森維藥有限公司)；(+)-兒茶素、福林酚/Folin&Ciocalteu’s phenol reagent、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁、石油醚(沸程60-90℃)、濃鹽酸、亞硝酸鈉(均為國產分析純)；RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Thermo公司)；一抗Tau(p ser-396)、Tau(p ser 199/202)、Tau(p Thr231)(美國Abcam公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 試驗儀器

調溫電熱套(DZTW型，北京市永光明醫療儀器有限公司)；電子分析天平(SQP型，德國賽多利斯)；恒溫水浴鍋(XMTD-7000型，北京市永光明醫療儀器有限公司)；酶標儀(Go 1510型，美國Thermo Fisher)；旋轉蒸發器(RE-52AA型上海亞榮生化儀器廠)；循環水式多用真空泵(SHB-BA95型，鞏義市英峪予華儀器廠)；數控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；垂直電泳儀(125-BR型，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(Gel Doc XR型，美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(Allegra 64R型，德國Benkman公司)。

2 試驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱量干燥恒重蘆丁5 mg，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.05 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標準品溶液至25 mL容量瓶中，加70%乙醇至10 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.7 mL，混勻靜置6 min后，各加入10%硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻后靜置6 min。最后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，靜置15 min。檢測不同濃度標準品510 nm波長處的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，得回歸方程為：A=0.1218C+0.0006，R2=0.9976；A為吸光度，C為蘆丁的濃度(mg/mL)。

2.2 阿納其根總黃酮的提取及得率測定

精密稱取干燥的藥材粗粉2 g，加入70%乙醇溶液20 mL，浸泡12 h，80℃水浴，回流提取2 h，提取2次，減壓抽濾，合并濾液，于70℃條件下減壓濃縮，干燥，稱重。準確稱取樣品20 mg，加70%的乙醇溶液50 mL。取樣品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按2.1方法操作，測定樣品吸光值，按照公式(1)計算黃酮得率。

黃酮得率(mg/g)=C×5×V/M

(1)

式中：C為回歸方程計算的樣品黃酮含量，(mg/mL)；5為測定用樣品體積，mL；V為樣品總體積，mL；M為阿納其根質量，g。

2.3 單因素試驗設計

精密稱取藥材粗粉2g，其他條件固定不變，分別對液料比、提取時間、提取次數、提取溫度、乙醇濃度5個因素進行單因素試驗。液料比分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1；提取時間分別為1、2、3、4 h；提取次數分別為1、2、3、4次；提取溫度分別為60℃、80℃、100℃；乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%；然后減壓抽濾，濃縮，干燥，稱重。按2.2項下方法進行測定，依據回歸方程計算總黃酮含量。

2.4 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、液料比(D)為自變量，阿納其根總黃酮含量(Y)為響應值，采用4因素3水平的響應面法進行試驗，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素與水平

2.5 阿納其根總黃酮對OA損傷PC12細胞存活率的影響

取對數生長期PC12細胞，接種于96孔培養板培養48 h，設空白組、對照組、模型組和阿納其根總黃酮給藥組(2.5、5.0、10.0 mg/mL)，每組設6個平行孔?？瞻捉M(不含細胞)加入等體積不含OA的PBS溶液，對照組加入等體積不含OA的培養液，模型組和給藥組加入含有20 nmoL/LOA1640培養基，37℃溫育24 h后吸棄培養基，給藥組再加入含有不同濃度阿納其根總黃酮(2.5、5.0、10.0 mg/mL)的培養基(空白組加入等體積PBS溶液，對照組及模型組加入同體積細胞培養液)，然后繼續培養24 h后，空白組每孔加入20 μL PBS溶液，其余各組每孔加入20 μL(5 g/L)的MTT，反應4 h，吸出溶液，空白組每孔加入100 μL PBS溶液，其余各組每孔加入等體積DMSO，震蕩混勻，在酶標儀490 nm波長處檢測吸光度值[11]。細胞存活率(%)=(加藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.6 阿納其根總黃酮對OA損傷PC12細胞Tau蛋白過度磷酸化的影響

用24孔細胞板培養細胞，每組設3個平行孔，同1.6的方法造模、給藥后，吸棄培養基，加入PBS將細胞吹打下來，混懸，1000 r/min離心10 min，用PBS反復洗2次，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。用5% 濃縮膠和10%分離膠電泳，濕轉，封閉。一抗(1：1000)4℃孵育過夜，1×TBST震蕩洗滌3次，二抗(1：3000)孵育1h，1×TBST洗滌3次。避光，加入現配發光液，曝光，照相，用軟件定量分析。

2.7 數據處理

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

從圖1(A)可見，在液料比為8∶1～14∶1范圍內，隨著乙醇用量的增加，總黃酮得率逐漸提高，在液料比為12∶1時趨于平緩，故選擇料液比8∶1～12∶1進行響應面優化分析。從圖1(B)可見，在提取時間為60～100 min范圍內，隨著提取時間延長，總黃酮得率先提高后降低，于2 h時最高，故選取提取時間1～3 h 進行響應面優化分析。從圖1(C)可見，在提取次數為1～4次范圍內，隨著提取次數增加，總黃酮得率先增大后減小，于提取2次時最大，故最終確定最佳提取次數為2次。從圖1(D)可見，在乙醇濃度為60%～90%范圍內，隨著乙醇濃度升高，總黃酮得率先增大后減小，乙醇濃度為70%時，總黃酮的提取效果最好，故選擇乙醇濃度60%～80%進行響應面優化分析。從圖1(E)可見，在提取溫度為60～100℃范圍內，總黃酮得率呈現先升后降的趨勢，于提取溫度為80℃時達到最高，之后有所下降，故選取提取溫度為70～90℃進行響應面優化分析。

圖1 單因素試驗結果

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 響應面試驗設計及結果

綜合單因素結果，按照表1的因素與水平設計響應面試驗，響應面分析結果見表2。由表2可以看出，各因素的中心點試驗阿納其根黃酮含量值均高于析因點試驗，與單因素試驗結果相符，說明該響應面設計的29個試驗點可信度較高。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

3.2.2 回歸方程的建立及方差分析

Design-Expert軟件對試驗所得數據進行方差分析和多元二次回歸擬合，見表3。

表3 阿納其根醇提物總黃酮提取回歸模型的方差分析

由方差分析結果可知，推測影響提取率因素為A> C> D> B，模型P<0.01，表明響應面回歸達到極顯著水平，模型回歸顯著可靠，A、C、D因素對阿納其根黃酮得率的影響極顯著(P<0.01)。同時，A的平方項對阿納其根總黃酮得率的影響極顯著，C和D的交互作用以及C和D的平方項對阿納其根總黃酮得率影響顯著，說明A、C和D對阿納其根總黃酮得率的影響不是簡單的線性關系，平方項和交互項也有很重要的作用，這與模型分析的結果相符；失擬項P=0.0633>0.05，表明實驗以外的其他因素對本實驗的影響??；模型的R2為 97.63%，接近1，證明試驗數據較可靠，該模型擬合度較高，可以用于乙醇提取阿納其根總黃酮的理論預測。

3.2.3 響應面分析

分別以A、B、C和D為響應因子，由回歸方程得出對應的響應面分析圖和等高線分析圖，直觀分析各因素交互作用對阿納其根醇提物總黃酮率的影響。

乙醇濃度與提取時間、提取溫度和液料比的交互作用對阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(A)、2(B)、3(C)所示，乙醇濃度在60%～65%時，阿納其根總黃酮提取率逐漸增高，乙醇濃度超過65%時，總黃酮提取率隨乙醇濃度降低而減少，固定乙醇濃度時，總黃酮提取率均隨提取時間、提取溫度和液料比的增大而增加；提取時間與提取溫度和液料比的交互作用對阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(D)、2(E)所示，固定提取時間時，總黃酮提取率隨提取溫度和液料比的增大而增加，而固定提取溫度和液料比時，總黃酮提取率隨提取時間的變化不明顯；提取溫度與液料比的交互作用對阿納其根總黃酮提取率的影響如圖2(F)所示，固定提取溫度時，總黃酮提取率隨液料比的增大而增加，而固定液料比時，總黃酮提取率隨提取溫度的升高而明顯增加。圖2(B)、2(C)、2(F)對響應面坡度影響最大，說明乙醇濃度與提取溫度、料液比對總黃酮的提取影響較大。

圖2 不同影響因素交互作用的響應面圖(左側)和等高線圖(右側)

3.2.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

根據響應面圖直觀分析，由Design-Expert軟件分析出醇提法提取阿納其根總黃酮的最佳提取條件為提取溫度87.93℃、乙醇濃度64.46%、液料比11.79 mL/g、提取時間62 min，回歸方程預測值為11.0458 mg/g。為了驗證該方法的可行性，結合實際的操作情況，在提取溫度90℃、乙醇濃度為65%、提取時間為60 min、液料比12 mL/g 的條件下重復3次試驗，得到阿納其根總黃酮含量為(11.66±0.12)mg/g，與方程預測值相吻。

3.3 阿納其根總黃酮對岡田酸損傷PC12細胞存活率的影響

由圖3可見，與對照組細胞相比，模型組PC12細胞經20 nmoL/L岡田酸損傷24 h后，細胞存活率顯著降低，模型組存活率僅為(61.06±4.07)%(P<0.01)。與模型組相比，阿納其根總黃酮各給藥組能夠明顯改善岡田酸損傷PC12細胞的現象，顯著提高細胞存活率(P<0.01)，并呈現劑量依賴性。

圖3 阿納其根總黃酮對岡田酸損傷的PC12細胞存活率的影響

3.4 阿納其根總黃酮對岡田酸損傷PC12細胞Tau蛋白過度磷酸化的蛋白表達檢測

由圖4可見，與對照組相比，模型組細胞Tau蛋白ser-199/202、ser-231和 ser-396位點磷酸化的表達水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，阿納其根總黃酮各給藥組細胞Tau蛋白這四個位點的磷酸化表達水平均呈現不同程度的降低，尤其10.0 mg/L劑量組顯著減少Tau蛋白這四個位點的磷酸化表達(P<0.05，P<0.01)，其中阿納其根總黃酮對Tau蛋白ser-199/202這個位點的作用最強，在5.0 mg/L劑量時就能明顯降低其磷酸化表達水平(P<0.05)。

圖4 阿納其根總黃酮對岡田酸損傷的PC12細胞Tau蛋白磷酸化的影響

4 討 論

由Design-Expert響應面優化得出最佳條件并按實際操作情況修改的提取阿納其根總黃酮工藝為提取溫度90℃、乙醇濃度65%、液料比12 mL/g、提取時間60 min。在此工藝條件下，阿納其根醇提物總黃酮得率預測值為11.05%，驗證值為11.66%，與預測值的相對誤差為0.61%。

前期研究報道阿納其根醇提物對記憶障礙小鼠有改善學習記憶的作用[12]，以及調節岡田酸損傷的PC12細胞周期和抑制細胞早期凋亡的作用[7]，但其作用機制不清楚。岡田酸能夠促使神經元微管相關蛋白Tau蛋白過度磷酸化，而這種現象與神經元變性、神經細胞突觸減少以及機體的記憶障礙相關[13]。結果顯示，在此工藝下獲得的阿納其根總黃酮，在2.5～10.0 mg/mL劑量范圍內對岡田酸損傷的PC12細胞具有明顯的改善作用，提高細胞存活率，而在10.0 mg/mL 劑量時能夠顯著降低岡田酸誘導的Tau蛋白在ser-199/202、ser-231和ser-396位點磷酸化水平增高，表明阿納其根對岡田酸誘導PC12細胞Tau蛋白過度磷酸化具有明顯的抑制作用，提示其保護神經細胞的作用與其具有調節微管相關蛋白穩定性，起到維持細胞骨架和細胞形態作用，從而達到提高神經細胞的存活率和保護細胞的作用有關。

綜上所述，阿納其根總黃酮得率響應方程的回歸分析和驗證試驗表明，此方法合理可行，利用響應面法得到的阿納其根醇提物總黃酮提取工藝參數真實有效，這是首次對阿納其根醇提物總黃酮提取的工藝優化，具有參考價值。阿納其根總黃酮能夠抑制岡田酸致PC12細胞Tau蛋白的過度磷酸化，具有促進Tau蛋白去磷酸化的作用，為其進一步的研發和應用提供了實驗數據。