冰菖散吸嗅劑制備及其對MCI模型小鼠的干預效果研究

周春梅，顧曉群，白 宇，徐奚如，張 彪*

(1.南京中醫藥大學 附屬醫院/江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023)

芳香類中草藥干預神經系統疾病古今均有大量研究，在防治認知障礙方面也取得了一定的療效成果[1]。輕度認知障礙(Mild cognitive impairment, MCI)是介于正常衰老和阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)之間的一種過渡狀態，被認為是防治AD的“黃金期”[2]。中醫將MCI歸類為“健忘”，其病因：以腎虛精虧為本，以痰淤交阻為標。冰菖散是江蘇省中醫院老年科自主研制用于早期干預MCI的經驗方[3-4]，用法是將冰片(Borneolum)、石菖蒲(Acorustatarinowii)、丁香(CaryophylliFlos)、豬牙皂(GleditsiaeFructusAbnormalis)、川芎(RhizomaChuanxiong)等磨粗粉裝嗅泵鼻吸。其中，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，芳香濃烈，善“開竅豁痰、醒神益智”；豬牙皂為豆科植物皂莢的成熟干燥不育果實，氣微，能“開竅祛痰”；川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，氣濃香，善“活血行氣”；丁香為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，芳香濃烈，既“開竅”又“健脾益腎”；冰片為龍腦香科植物龍腦香樹脂析出的天然結晶，氣清香，善“開竅”。全方“開神竅、化痰淤、補脾腎”，藥少力專，前期臨床研究表明：吸嗅冰菖散能顯著改善遺忘型輕度認知障礙(Amnestic mild cognitive impairment，aMCI)患者的情節記憶[3]。

為適應工業生產，本研究將通過鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取出冰菖散中石菖蒲、丁香、豬牙皂、川芎四味中藥的混合揮發油以提高諸藥“香氣”的利用率，再加入冰片制備成更加科學規范的冰菖散吸嗅劑，并通過經鼻給藥干預MCI模型小鼠觀察其療效，以期為MCI乃至AD的預防提供參考依據。

1 冰菖散中揮發油提取工藝優化

1.1 儀器與材料

1.1.1 主要儀器

循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司,SHZ-D(Ⅲ)型)；氣相色譜-質譜聯用儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司,Thermo Trace 1300-ISQ QD型)；超聲波清洗器(KH-500DE型)；電子分析天平(德國賽多利斯集團，BL4100型)；電子分析天平(日本島津公司，AUY 120型)。

1.1.2 主要試劑與藥材

石菖蒲(安徽，切制，批號：201001)、丁香(江蘇，凈制，小份藥無批號)、豬牙皂(山東，凈制，小份藥無批號)、川芎(四川，切制，批號：202002)、冰片(貴州，批號：200301)，經南京中醫藥大學朱育鳳教授鑒定符合2015版《中國藥典》一部相關項下規定。氯化鈉(分析純，天津恒興精細化工，批號：20181211)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180115)；乙酸乙酯(分析純，廣東光華科技股份有限公司，批號：20181129)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法和結果

1.2.1 揮發油正交試驗設計

根據《中國藥典》2015年版四部揮發油測定方法及相關文獻[5-6]采用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發油并稍作修改，提取時間統一為2 h。根據預試驗結果，以揮發油的提取量為考察指標，設計 L9(3)3正交試驗因素水平表，見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.2 揮發油的提取與結果

分別按照上述因素水平表安排實驗，加熱提取過程中隨時收集揮發油，結束后合并[7]，用無水硫酸鈉干燥靜置離心，讀取體積后移入棕色瓶中，密封于4℃冰箱保存備用，結果見表2。

表2 L9(3)3正交試驗設計與結果

1.2.3 正交試驗結果分析

方差分析顯示(見表3)，NaCl鹽析輔助對水蒸氣蒸餾法提取揮發油有顯著影響(P<0.05)，而料液比和水浴時間沒有統計學意義。

表3 方差分析結果

1.2.4 驗證實驗

稱取石菖蒲10 g、豬牙皂10 g、丁香10 g、川芎10 g，按上述最佳工藝進行驗證實驗(n=3)，揮發油得量分別為1.51、1.49和1.51 mL，可見該工藝條件穩定且重復性好。

1.3 化學成分檢測

1.3.1 GC-MS條件

HP-5MS超高惰性毛細管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，載氣為氦氣(純度為99.999%)，流速為1 mL/min；進樣口溫度為250℃；分流進樣，分流比40:1；程序升溫，升溫梯度見表4；進樣量為1 μL；電離方式EI，離子源溫度為280℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度為280℃，質量掃描范圍50～500 m/z，溶劑延遲時間3 min。

表4 程序升溫梯度

1.3.2 GC-MS結果與分析

在冰菖散混合揮發油中加入適量乙酸乙酯制成供試品溶液，按上述條件進行GC-MS分析，并用NIST質譜圖庫進行計算機檢索和歸一化法計算相對含量見表5，總離子流圖見圖1。

圖1 冰菖散揮發油總離子流

由表5可知，冰菖散混合揮發油主要化學成分中一半以上是丁香酚(55.88%)，是丁香和石菖蒲的主要成分之一。石菖蒲另外兩種成分α-細辛醚和γ-細辛醚相對含量分別為2.19%、1.17%，川芎的主要成分藁本內酯相對含量為1.75%。

表5 冰菖散混合揮發油主要化學成分

1.4 冰菖散吸嗅劑制備

1.4.1 人用量換算

冰菖散人臨床用法為5 g藥粉(冰片∶石菖蒲∶豬牙皂∶丁香∶川芎=2∶1∶1∶1∶1)吸嗅10 min(每天兩次共兩周)[3-4]，根據前述正交試驗可折算出人每天10 min最多吸嗅混合揮發油量約0.7 μL。再根據相關文獻[8]折算出人每天10 min最多吸嗅冰片量約0.3 mg，

1.4.2 小鼠用冰菖散吸嗅劑制備

按人與動物體表面積等效劑量比值換算得：小鼠每天混合揮發油給藥量約0.1 μL，冰片給藥量約0.05 mg。取100 μL混合揮發油和50 mg冰片細粉混合并超聲處理5 min即得小鼠用冰菖散吸嗅劑，分裝于棕色瓶內密封保存，4℃冷藏備用。

2 冰菖散吸嗅劑經鼻給藥干預MCI小鼠的療效研究

2.1 主要儀器與材料

多功能酶標儀(EnSpire，2300型)，臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，型號5417R)，熒光倒置顯微鏡攝像系統(Olympus，型號：DM13000D)，小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(上海酶聯，批號：20200819)，鹽酸多奈哌齊(99%，北京華威銳科化工，批號：HW18C2607-2)，剛果紅染液套裝(Servicebio，貨號：G1056)，冰菖散吸嗅劑(“1.4.2”制備所得)。

2.2 藥物干預

5月齡雄性APP/PS1小鼠12只隨機分為：中藥組，西藥組，模型組；5月齡雄性C57BL/6小鼠4只作為對照組，均購自南京君科生物工程有限公司。中藥組予冰菖散吸嗅劑(用移液槍打入小鼠鼻孔，每孔0.1 μL)；西藥組予鹽酸多奈哌齊灌胃(0.65 mg/kg)，模型組和對照組予等劑量生理鹽水灌胃。均單籠單只飼養，共給藥兩周。研究過程經南京中醫藥大學倫理委員會審核批準通過(倫理審查編號：201908A011)。

2.3 筑巢行為檢測

2.3.1 方法

給藥兩周后，第二天在每籠中換入厚約1 cm的刨花墊料，于夜節律前2 h均勻平鋪放入邊長4.5 cm的正方形無味薄紙巾片16張。在2 h后對小鼠筑巢質量進行打分，根據相關文獻[9-10]改良的評分標準如下：0分，完全沒碰紙片；1分，紙片散落在籠子各處，無咬痕；2分，紙片被聚集到籠子一側，但較松散沒有成型的巢，無明顯咬痕；3分，紙片聚攏折疊，可見成型但較平的巢，部分被撕咬；4分，紙片被撕咬成小塊聚攏折疊成較深的巢，見圖2。均采用盲法打分，記錄小鼠筑巢分數。

圖2 筑巢質量評分標準

2.3.2 結果與分析

如圖3所示，給藥兩周后，中藥組和西藥組MCI模型小鼠的筑巢質量得分均顯著提高，與模型組相比，均具有顯著統計學差異(P<0.01)。

圖3 冰菖散吸嗅劑對5.5月齡小鼠筑巢得分的影響(**P<0.01)

2.4 病理指標檢測

筑巢實驗結束后，每組隨機選3只小鼠用于取材，統計分析同“2.3.2”。

2.4.1 方法

2.4.1.1 采用ELISA法檢測TNF-α含量

無菌采血，離心后取血清保存于-80℃備用。方法及步驟按照試劑盒說明書進行操作，繪制標準曲線，然后計算相應小鼠的TNF-α含量，結果見圖4。

2.4.1.2 通過剛果紅染色檢測Aβ沉積情況

取腦組織固定24 h，常規石蠟包埋、切片(厚度4-5 μm)，將切片進行脫蠟至水，然后放入剛果紅染液1 h，純水洗2 min，氫氧化鉀溶液分化至背景基本無色、陽性斑塊明顯，純水清洗，蘇木素復染3-5 min，純水清洗，返藍液返藍，再次用純水沖洗，然后脫水、透明，中性樹膠封片，采集圖像，結果見圖5。并運用Image Pro Plus計算Aβ斑塊面積用于統計分析，結果見圖6。

圖6 冰菖散吸嗅劑對5.5月齡小鼠腦皮層中Aβ斑塊面積的影(***P<0.001)

2.4.2 結果與分析

2.4.2.1 小鼠血清TNF-α含量

如圖4所示，給藥兩周后，中藥組和西藥組MCI模型小鼠血清中TNF-α含量均顯著降低，與模型組相比，均具有非常顯著統計學差異(P<0.001)。

圖4 冰菖散吸嗅劑對5.5月齡小鼠血清中TNF-α含量的影響(***P<0.001)

2.4.2.2 小鼠腦中Aβ沉積情況

如圖5、6所示：模型組MCI模型小鼠腦皮層和海馬中均出現Aβ斑塊，中藥組MCI模型小鼠腦皮層和海馬均沒有Aβ沉積，而西藥組MCI模型小鼠只有皮層存在少量Aβ沉積，與模型組相比，具有非常顯著統計學差異(P<0.001)。

圖5 冰菖散吸嗅劑對5.5月齡小鼠腦中Aβ沉積情況的影響

3 討 論

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經系統進行性衰退疾病，俗稱老年癡呆，早期以記憶力下降為主，逐漸發展為失能、失用，后期多半生活不能自理[11-12]。據推測[13]，到2050年我國的AD患者將超過3000萬，給家庭和社會造成巨大負擔。遺憾的是，至今所研制的藥物均不能逆轉AD的病情發展，而MCI是AD的臨床前期，相對于不可逆的AD，早期干預MCI更有價值。西藥副作用大，中藥湯劑雖有效但療程太長易加重脾腎負擔，冰菖散是江蘇省中醫院老年科按照“簡便廉驗”的原則自主研制用于早期干預MCI的經驗方[3-4]，配伍精妙緊扣MCI病機。另外，方中君藥冰片善開竅，現代藥理研究也表明，冰片可以促進血腦屏障生理性開放[14]，再加上鼻吸的使用方法，使藥物直達腦組織。

通過鹽析輔助水蒸氣蒸餾法先將四味中草藥(石菖蒲、丁香、豬牙皂、川芎)的揮發油提取出來，再將冰片按相應比例混入制備成更加科學規范的冰菖散吸嗅劑。水蒸氣蒸餾法設備簡單、容易操作，是最為常用的揮發油提取方法。加入氯化鈉不僅能加速揮發油餾出，還能促使油水分層，另外將提取時間限定為2 h，可以減少由于系統開放、溫度較高等原因造成的損失。優選出的揮發油提取條件出油量較高，且穩定可行，對工業生產有一定的參考價值。

進一步運用MCI模型APP/PS1小鼠進行了為期兩周的療效研究。(1)筑巢行為檢測是最為簡便的療效初查手段，給藥兩周后中藥組(冰菖散吸嗅劑)和西藥組(多奈哌齊)筑巢質量均顯著提高。(2)由Aβ沉積形成的老年斑是AD典型病理標志之一，最早出現于AD臨床癥狀前幾十年即MCI期(從內嗅皮層逐漸累及到海馬)，減少Aβ沉積是干預MCI的關鍵內容之一。結果表明：在MCI早期使用冰菖散吸嗅劑經鼻給藥能顯著減少甚至消除MCI模型小鼠腦組織中的Aβ斑塊。(3)由Aβ沉積引發的炎癥連鎖反應也是MCI的重要病理表現，會導致神經系統產生大量的炎癥因子，其中TNF-α是出現最早的促炎因子[15]。分析ELISA檢測結果發現，冰菖散吸嗅劑可以顯著降低MCI模型小鼠血清TNF-α濃度。GC-MS分析結果顯示冰菖散混合揮發油的主要成分中超過一半是丁香酚，和方中君藥冰片一樣都具有非常強的抗炎、殺菌作用。

本試驗仍然存在一些不足，如水蒸氣蒸餾法雖然簡便易行，但耗時太長、溫度較高、系統開放會造成一定的損失，條件允許可以采用較完善的超臨界CO2二萃取法；療效實驗的病理指標還可以進一步挖掘，后續將開展抗炎機制(如信號通路SIRT1/NF-κB)以及抗凋亡作用等方面的研究。