A549細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王璐璐，劉丹陽(yáng)，李永濤，金海峰，姜楊，張善強(qiáng)，沈雷

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

肺癌患病率位居惡性腫瘤之前列，全世界每年大約有60萬(wàn)人死于肺癌[1]。盡管手術(shù)、化學(xué)藥物治療或放射治療等不同治療策略被應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但是卻仍然無(wú)法阻止肺癌的進(jìn)展[2]。肺癌組織內(nèi)也含有肺癌干細(xì)胞[3]，并認(rèn)為肺癌干細(xì)胞有可能來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSC）[4-5]，MSCs具有較強(qiáng)的歸巢特性可能是造成肺癌等腫瘤浸潤(rùn)或發(fā)生轉(zhuǎn)移的因素之一[5-6]。關(guān)于肺癌微環(huán)境對(duì)MSC增殖等細(xì)胞生物學(xué)影響還需要深入研究。

趨化因子能夠與MSCs表面相應(yīng)受體相互結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞遷移歸巢能力的肽類(lèi)家族[7]。白細(xì)胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）與乳腺癌、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[8]。該實(shí)驗(yàn)從趨化因子角度驗(yàn)證肺癌A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs增殖和凋亡的影響，為抑制肺癌細(xì)胞增生提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人正常肺上皮BEAS-2B細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC）均購(gòu)于美國(guó)ATCC公司。

1.2 主要試劑和儀器

人IL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。美國(guó)Bio-Rad公司的Bio-Rad 550酶標(biāo)儀；美國(guó)BD公司FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞；hBMSCs用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 提取細(xì)胞上清液4×106 BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后，800 rpm離心5 min，分別提取兩種細(xì)胞上清液，0.22μm濾器抽濾。

1.3.4 細(xì)胞分組BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞上清液用含1%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基按體積比1:4稀釋為條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，CM）。以A549 CM和BEAS-2B CM培養(yǎng)hBMSCs分別為A549-CM組和BEAS-2B CM組。正常培養(yǎng)的hBMSCs為對(duì)照組。

1.3.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)0.8×104各組hBMSCs，分別加入各組條件培養(yǎng)基或正常培養(yǎng)基。37℃，5% CO2培養(yǎng)6 h后，加入5 g/L MTT溶液；37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再添加DMSO。Bio-Rad 550酶標(biāo)儀于490 nm檢測(cè)細(xì)胞增殖吸光度（Absorbance value，A值）。

1.3.5 Annexin V-PI細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)3.5×105各組hBMSCs用1.25% Annexin V-FITC溶液重懸孵育20 min；10 000 rpm離心5 min；0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；再加入2% PI溶液，4℃孵育2 min，10 000 rpm離心5 min；取上清液，0.01 mmol/L PBS重懸。FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 ELISA 5×105各組hBMSCs，加入RIPA細(xì)胞裂解液及1 mmol/L PMSF，4℃，10 000 rpm離心5 min；BCA法測(cè)定蛋白總濃度。使用人Akt、P-Akt的ELISA試劑盒檢測(cè)各種蛋白的含量。A549細(xì)胞上清液和BEAS-2B細(xì)胞上清液的IL-8蛋白含量使用人IL-8的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞上清液促進(jìn)hBMSCs增殖

對(duì)照組、BEAS-2B CM組和A549-CM組hBMSCs的A值分別為（0.97±0.19）、（1.01±0.09）、（1.79±0.13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=125.93，P＜0.01）。

圖1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs細(xì)胞凋亡的影響

2.2 A549細(xì)胞上清液抑制hBMSCs凋亡

對(duì)照組、BEAS-2B CM組、A549-CM組hBMSCs的凋亡率分別為10.81%、9.31%和6.05%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.75，P＜0.01）。A549-CM組hBMSCs的凋亡率分別是對(duì)照組的0.56倍和0.65倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.3 A549和BEAS-2B細(xì)胞上清液中IL-8蛋白的含量

ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞上清液中IL-8含量是（18.16±2.23）μg/mL，BEAS-2B細(xì)胞上清液IL-8含量是（10.07±1.55）μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.510，P＜0.01）。

2.4 A549細(xì)胞上清液促進(jìn)hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

對(duì)照組、BEAS-2B CM組、A549-CM組Akt、p-Akt蛋白含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A549-CM組hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白含量均比對(duì)照組和BEAS-2B CM組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影響比較[（±s），μg/mL]

表1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影響比較[（±s），μg/mL]

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.01；與BEAS-2B-CM組比較，*P＜0.01

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3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞與其微環(huán)境內(nèi)的宿主細(xì)胞相互影響。王志紅等[9]為探討MSC歸巢到電離輻射損傷的小鼠組織，將BALB/c小鼠經(jīng)1.75 Gy X線進(jìn)行全身照射4周，制備電離輻射誘發(fā)的胸腺組織損傷動(dòng)物模型，并由小鼠尾靜脈注入MSCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)照射組小鼠第1天MSCs即可出現(xiàn)在損傷胸腺組織內(nèi)，第10天MSCs在放射胸腺組織內(nèi)大量分布。MSC是腫瘤微環(huán)境的組成部分，但是惡性腫瘤組織招募MSCs的機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)MSC誘導(dǎo)胃癌HGC27細(xì)胞遷移和侵襲，MSC尚可增加胃癌細(xì)胞Snail間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，降低N-cadherin、E-cadherin上皮標(biāo)志物表達(dá)，HGC27細(xì)胞與MSC聯(lián)合培養(yǎng)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的干性，這為MSC在胃癌中的作用提供了新的證據(jù)，也為提高M(jìn)SC靶向治療胃癌的效率提供了機(jī)會(huì)[10]。

該實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤微環(huán)境對(duì)MSCs增殖或凋亡的影響，對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之間的關(guān)系展開(kāi)研究。相對(duì)于對(duì)照組、BEAS-2B CM組的A值（0.97±0.19）、（1.01±0.09），A549-CM組hBMSCs細(xì)胞A值為（1.79±0.13），說(shuō)明A549-CM組hBMSCs細(xì)胞增殖非常明顯。但是3組細(xì)胞的凋亡率相比，A549-CM組hBMSCs細(xì)胞凋亡率約為5.64%，呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)。Li W研究發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞在常氧條件下分泌HIF-1α蛋白，維持腫瘤生長(zhǎng)和遷移，A549細(xì)胞Transwell遷移率約為89.26%，若以HIF-1 miRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞抑制HIF-1α表達(dá)，則出現(xiàn)HIF-1α沉默顯著抑制A549細(xì)胞遷移的情況，此時(shí)Transwell遷移率約為51.43%，提示A549惡性腫瘤細(xì)胞能夠分泌促進(jìn)腫瘤自身生長(zhǎng)的HIF-1α細(xì)胞因子[11]。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞上清液中IL-8含量為（18.16±2.23）μg/mL，明顯高于BEAS-2B-CM組上清液IL-8含量（10.07±1.55）μg/mL。國(guó)內(nèi)學(xué)者李林等[12]在慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺癌患者血清中也發(fā)現(xiàn)，41例COPD合并肺癌患者組血清內(nèi)的IL-6、IL-8和TNF-α分別為（186.73±0.92）ng/L、（298.28±27.81）ng/L和（147.51±2.32）ng/L；41例單純COPD組患者血清內(nèi)IL-6、IL-8和TNF-α含量（20.92±22.67）、（45.47±15.94）、（86.04±1.05）ng/L，兩組IL-6、IL-8和TNF-α指標(biāo)分別比較發(fā)現(xiàn)COPD合并肺癌患者組血清內(nèi)IL-6、IL-8和TNF-α含量比單純COPD組明顯高表達(dá)。由此可見(jiàn)，該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與李林等學(xué)者的研究結(jié)果相類(lèi)似，即相對(duì)于單純COPD細(xì)胞或正常肺上皮細(xì)胞，肺癌細(xì)胞能夠高表達(dá)的IL-8細(xì)胞因子能夠更好維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。可見(jiàn)IL-8等活性因子對(duì)促進(jìn)腫瘤等細(xì)胞自身增殖，維持自我更新起到積極作用。

IL-8能夠激活細(xì)胞內(nèi)Akt-STAT3信號(hào)通路，啟動(dòng)微絲微管收縮而促進(jìn)脂肪或骨髓源MSCs遷移[13-14]。IL-8與卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤的分級(jí)分期密切相關(guān)，IL-8與腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（淋巴管新生）、血管轉(zhuǎn)移（血管新生）呈現(xiàn)正向關(guān)系[15-16]，提示從趨化因子角度闡明非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境對(duì)MSC的影響會(huì)有新發(fā)現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)ELISA試驗(yàn)證實(shí)A549細(xì)胞上清液中IL-8蛋白含量明顯高于正常肺BEAS-2B細(xì)胞組，進(jìn)一步說(shuō)明A549細(xì)胞可以表達(dá)IL-8蛋白等趨化因子[12]。IL-8蛋白能夠與MSCs表面的CXCR1/2受體特異結(jié)合，活化細(xì)胞遷移過(guò)程[13-14,17]。BEAS-2B-CM組hBMSCs的A值或細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異的原因可能是由于正常人肺細(xì)胞BEAS-2B所表達(dá)的活性物質(zhì)較少，在接下來(lái)的ELISA實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了BEAS-2B上清液中IL-8含量比非小細(xì)胞肺癌A549上清液IL-8含量低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A549-CM組hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，這與學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)的IL-8蛋白或IL-8受體活化后，能夠促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞等細(xì)胞遷移相類(lèi)似[13,18]。Akt信號(hào)通路與很多已知調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的Notch、Wnt等信號(hào)通路還諸多交叉作用[19-20]。關(guān)于A549細(xì)胞分泌的其他活性因子成分以及對(duì)MSCs的影響，還需要繼續(xù)利用高效液相色譜技術(shù)、基因組學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等技術(shù)進(jìn)行深入研究和驗(yàn)證。