掃描電鏡在觀察潰瘍性結(jié)腸炎果蠅腸道超微結(jié)構(gòu)中的應用研究

王 博 車 暢 關(guān) 旸 王林燕

(1.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，杭州 310053；2.中國計量大學生命科學學院，杭州 310018)

潰瘍性結(jié)腸炎作為臨床常見的慢性特異性腸道炎癥，近年來發(fā)病率急劇上升，其病因至今仍不明確，可能是由環(huán)境及遺傳等因素相互作用形成。其病理特征主要包括腸道黏膜及下層出現(xiàn)炎癥反應等[1]。外界環(huán)境中多種致炎因子會誘發(fā)腸炎，其中葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium,DSS)是一種哺乳動物潰瘍性結(jié)腸炎模型構(gòu)建的常用藥物，其誘導結(jié)腸炎的機制可能與T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等激活后引起細胞因子表達改變，導致腸上皮屏障破壞有關(guān)[2]。黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)作為模式生物，腸道結(jié)構(gòu)相對簡單，其細胞炎癥的發(fā)生過程及其分子機理與哺乳動物類似，且果蠅成蟲腸道包含同人腸道相似的細胞類型及細胞組成。因此通過果蠅研究潰瘍性結(jié)腸炎與腸道超微結(jié)構(gòu)的變化具有重要意義[3,4]。

掃描電鏡常用于觀察生物組織三維立體像，但在生物組織亞顯微鏡結(jié)構(gòu)研究中應用較少。例如在觀察腸道微絨毛、上皮細胞細胞器等方面需要透射電鏡[5]。隨著掃描電鏡分辨率的提高，通過掃描電鏡背散射模式對腸道切片成像，可以得到類似透射電鏡效果的圖像且具有成像范圍廣、易于獲取與收集切片等優(yōu)勢。基于此，本研究通過掃描電鏡對果蠅腸道超微結(jié)構(gòu)進行觀察，探究DSS誘導的潰瘍性結(jié)腸炎果蠅腸道超微結(jié)構(gòu)的變化。

1 實驗部分

1.1 儀器

場發(fā)射掃描電鏡(日立，型號，SU8010)，超薄切片機(萊卡，型號，EMUC7)

1.2 試劑

戊二醛(Alfa Aesar)；四氧化鋨(TED PELLA. INC)；Spon 812環(huán)氧樹脂(SPI CHEM)；檸檬酸鉛(SPI CHEM)；醋酸雙氧鈾(TED PELLA. INC)。

1.3 實驗動物

黑腹果蠅：野生型 Oregon R品系，飼養(yǎng)在標準玉米糊培養(yǎng)基中(水76 g，瓊脂1.5 g,糖13.5 g，玉米粉10 g，酵母粉0.7 g，丙酸0.5 mL)。培養(yǎng)溫度25℃，相對濕度60%。

1.4 潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立

選取羽化3～5天果蠅成蟲，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)管中飼喂3%DSS和5 %蔗糖混合溶液，處理3天；對照組僅用5%的蔗糖溶液進行飼喂。

1.5 掃描電鏡樣品制備與觀察

1.5.1 取材及固定

在預冷的PBS中解剖果蠅中腸在光學顯微鏡觀察，另取中腸放置在2.5%戊二醛4℃過夜固定。PBS洗脫5min×4次；1%四氧化鋨室溫下固定1h，PBS洗脫5 min×4次。

1.5.2 脫水、包埋和聚合

加入不同濃度梯度(50%，70%，90%，100%)的乙醇室溫下均處理10 min；丙酮室溫下處理20 min，丙酮與Spon 812樹脂(1:1和1:3)混合，室溫下分別處理1 h和3 h。100% Spon 812樹脂4℃過夜處理，樣品轉(zhuǎn)移至包埋板中加入100% Spon 812樹脂60℃熱聚合24 h。

1.5.3 切片、染色和觀察

切取樣品超薄切片(100 nm)轉(zhuǎn)移至硅片上。經(jīng)1%的醋酸雙氧鈾染色1 h，ddH2O漂洗后，滴加1%的檸檬酸鉛染色15 min并漂洗。將硅片放置在場發(fā)射掃描電鏡內(nèi)進行觀察。拍照參數(shù)為：加速電壓2 kV，收集HA-BSE電子信號，并將得到的圖片進行黑白反相。

2 結(jié)果

2.1 果蠅腸道解剖及光鏡觀察

圖1(A和B)分別為正常組和腸炎組果蠅中腸光學顯微鏡圖片。兩組腸道均結(jié)構(gòu)完整，無腸道壁破損或增厚現(xiàn)象，腸道內(nèi)無黑色素瘤積累以及腸道增生等現(xiàn)象。

圖1 果蠅腸道光學顯微鏡圖A.對照組；B. 腸炎組

2.2 DSS對中腸上皮細胞的影響

掃描電鏡觀察結(jié)果表明兩組腸道超微結(jié)構(gòu)具有部分差異。圖2(a-c)和圖2(d-f)分別為正常組和腸炎組腸道超微結(jié)構(gòu)圖。其中圖2a和圖2d為低放大倍數(shù)(600倍)總覽圖，可清晰分辨腸道壁、腸道內(nèi)腔以及腔內(nèi)物質(zhì)。進一步對腸道壁放大，可觀察到腸上皮細胞及腸道微絨毛(圖2b和圖2e)，其中正常組腸道微絨毛排列整齊、密集且絨毛較長，而腸

圖2 DSS對腸上皮細胞的影響a、b、c為對照組，bar=20μm, bar=4μm和bar=2μm；d、e、f為腸炎組，bar=20μm, bar=4μm和bar=2μm

炎組部分區(qū)域腸道微絨毛變短、稀疏甚至出現(xiàn)脫落。對腸道上皮細胞進一步放大可觀察到正常組上皮細胞內(nèi)包含大量線粒體，線粒體脊致密完整(圖2c)，腸上皮細胞間存在緊密連接結(jié)構(gòu)；相反腸炎組上皮細胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)較差(圖2f)。

2.3 DSS對果蠅腸道細胞組成和微生物的影響

在正常組中，觀察到位于腸上皮細胞之間的腸分泌細胞，該類細胞表面同樣具有類似微絨毛的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部存在囊泡(圖3a)；在腸炎組中沒有發(fā)現(xiàn)分泌細胞。另外在腸炎組中，觀察到多個分布于腸道壁肌層的腸道干細胞，它們具有細胞核大及細胞質(zhì)少的特點(圖3c)。

腸腔內(nèi)容物存在大量微生物，根據(jù)形態(tài)特征可以辨認包括真菌和細菌(球菌和桿菌)。其中腸炎組中腸道微生物密度高于對照組(圖3b和圖3d)。

圖3 DSS對腸道細胞組成及微生物的影響a, b為對照組，bar=6 μm和bar=8 μm；c, d為腸炎組，bar=8 μm和bar=8 μm

3 討論

隨著顯微成像技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代病理學研究逐步從組織水平深入到細胞乃至亞細胞水平。尤其是掃描電鏡分辨率的大幅提升，使得通過采集生物切片背散射電子信號，繼而對超微結(jié)構(gòu)的研究成為可能。背散射電子成像的襯度主要由樣品原子序數(shù)的高低決定。原子序數(shù)越大獲得的背散射電子越多，接收到信號則越強，圖像越亮。然而生物組織和細胞的結(jié)構(gòu)成分主要為輕元素，由于原子序數(shù)較小，對電子束排斥能力低，因而對電子散射的能力就小，顯示出的超微結(jié)構(gòu)也極其模糊。當對樣品重金屬(鋨、鈾和鉛等)染色后，它們能與組織和細胞的不同結(jié)構(gòu)成分進行不同程度的結(jié)合，從而使這些結(jié)構(gòu)散射電子的能力不同，以增強明暗之比從而呈現(xiàn)清晰的超微結(jié)構(gòu)。其中背散射電子多的結(jié)構(gòu)在圖像中表現(xiàn)出“淺亮”特征，背散射電子少的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出“深暗”特征，為了使掃描電鏡得到的灰度圖在閱片習慣上與透射電鏡相同，后續(xù)對采集的圖片還需黑白反相[6]。

腸道超微結(jié)構(gòu)的觀察對于探究腸道疾病病因、發(fā)生發(fā)展機制和形態(tài)功能變化尤為重要。，本研究在果蠅潰瘍性結(jié)腸炎組別中觀察到腸微絨毛脫落，胞質(zhì)內(nèi)線粒體脊及膜性結(jié)構(gòu)溶解等現(xiàn)象，這與哺乳動物(如大鼠等)潰瘍性結(jié)腸炎具有相同病理特征[7,8]。

過去曾有研究表明，當對esg-Gal4,UAS-GFP/Cyo品系果蠅(該品系中腸干細胞具有GFP自發(fā)熒光的表達)飼喂適量濃度的DSS后，在熒光顯微下可觀察到果蠅中腸干細胞數(shù)量激增[9]。在本研究中發(fā)現(xiàn)腸炎組在腸道上皮細胞下層出現(xiàn)多個中腸干細胞，它們具有細胞核大，細胞質(zhì)和細胞器少等干細胞具有的超微結(jié)構(gòu)特征(圖3c)，因此進一步證實DSS能刺激中腸干細胞數(shù)量激增。中腸干細胞分裂可用于補充腸道上皮細胞和腸分泌細胞等，從而參與腸道組織的修復[10]。因此推斷DSS處理會對腸道細胞造成損傷，中腸干細胞參與腸道組織的修復[11]。

果蠅中腸組成除包括上皮細胞和干細胞外，另包含少量腸分泌細胞[3]。腸分泌細胞表面具有化學感受器，通過感知腸道內(nèi)環(huán)境中各種物質(zhì)的變化做出適當反應，例如釋放激素到血液中[12]。結(jié)果顯示腸分泌細胞內(nèi)部具有多個囊泡，可能用于包裝激素進行分泌。此外在分泌細胞表面觀察到類似絨毛的結(jié)構(gòu)，可能包含化學感受器用于識別腸道內(nèi)環(huán)境(圖3a)。而在腸炎組中，經(jīng)多次切片均為發(fā)現(xiàn)腸分泌細胞，推測DSS可能對分泌細胞造成破壞。

腸炎組腸道微生物(包括酵母菌、桿菌和球菌)密度遠高于對照組。由于兩組之間的培養(yǎng)基均相同，因此推斷腸炎組包含大量酵母菌是由于酵母在果蠅腸道內(nèi)大量繁殖引起，即DSS處理促進了酵母菌的繁殖。過去有研究表明腸道微生物能夠影響宿主動物代謝功能和免疫功能。如益生菌中的乳酸桿菌和雙歧桿菌能夠預防腸道感染性腹瀉，甚至治療腸炎[13,14]。而酵母作為具有活性的微生物，它不僅能夠提供營養(yǎng)物質(zhì)，還能和果蠅可能具有相互間的作用影響寄主的代謝反應[15]，例如酵母菌能縮短果蠅發(fā)育時間，增加繁殖力和壽命，促進對病原體的免疫反應。因此推斷酵母菌大量繁殖可能用于提升腸道免疫應答反應用于消除腸道炎癥對宿主造成的不利影響。對于腸道細菌而言，由于其種類繁多，通過電鏡僅能辨別出球菌和桿菌，因此對于細菌和腸炎之間的關(guān)系還需進一步研究。

4 總結(jié)

本研究通過對果蠅飼喂葡聚糖硫酸鈉構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎模型，借助掃描電鏡背散射電子成像技術(shù)對腸道超微結(jié)果進行觀察，發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎模型較對照組而言，腸道微結(jié)構(gòu)遭到破壞，中腸干細胞增多，未見腸分泌細胞，腸道內(nèi)酵母菌數(shù)量增多。