高效液相色譜法測定大蒜素片中DADS和DATS的含量

李天昊 李若琦 黃雪婷 陳梅蘭*

(1．浙江樹人大學生物與環境工程學院，杭州 310015；2. 江蘇常州大學，常州 213164)

在我國，大蒜素是一類運用廣泛的抗菌藥，有抗氧化的作用，能調節人的心腦系統的功能，并且在降低血壓血脂以及抗癌方面也有一定的效果。大蒜素是大蒜中具有高度生物活性的主要成分的總稱，學名為二烯丙基硫代亞磺酸酯，化學式為C6H10OS2，是否下標常見于蔥屬植物中，在新鮮大蒜以及洋蔥等植物里存在。純品大蒜素是無色的油狀物，有大蒜的特殊氣味，微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙醚、正己烷等有機溶劑中[1]，在熱、堿中不穩定，在酸中較為穩定[2]。

但是新鮮大蒜產生的大蒜素極不穩定, 可迅速降解為揮發性的二烯丙基硫化物(Diallyl sulfide, DAS) 、二烯丙基二硫醚(Diallyl disulfide, DADS) 和二烯丙基三硫醚(Diallyl trisulfide, DATS) 等多種有機硫化合物[3]，其中DADS和DATS是與大蒜活性的主要成分[4]。DADS是一種有機硫化合物，有強烈的蒜臭味，也是大蒜油的揮發性成分，具有較好的抗癌作用[5]。DATS是由大蒜粉碎產生的揮發性有機硫化物化合物,具有其特殊的氣味,不溶于水和乙醇，可與乙醚混溶。DADS和DATS具有抗炎、抗氧化和免疫調節等藥用效果[6-8],因此常被制成藥片作為藥用治療，由于DADS和DATS是大蒜素中起作用的活性物質，因此藥片中DADS和DATS的含量有極其重要的意義。

目前關于大蒜中DADS、DATS等系列硫醚化合物測定的方法有很多, 主要有：紫外衍生化法、氣相色譜-質譜聯用法[9，10]、定硫法[11]、高效液相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等方法，但大都是對大蒜中單一成分的測定[14]。氣相色譜-質譜聯用法需要較高的溫度，而大蒜素在較高溫度下可能會分解，導致實驗結果的誤差；雖然定硫法方法簡便、快捷、試劑消耗量少【15】，但是其氧化劑用量、酸度、沉淀劑的用量都會對這次實驗的測定結果有影響。我們采用高效液相色譜法(HPLC)對大蒜素片中的DADS和DATS進行測定實驗，該方法操作方便簡單，精確度高。

1 儀器與材料

儀器：Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀(包含二元泵、紫外/可見檢測器等，美國賽默飛世爾科技公司)；恒溫磁力攪拌水浴鍋；超聲波清洗機；布氏漏斗。

材料：超濃縮大蒜片(200mg/片，杭州綠寶食生物科技有限公司)；DADS(濃度為85%，macklin試劑)；DATS(濃度為65%，macklin試劑)；超純水(≥18.2M·cm，美國Millipore有限公司)；甲醇作為色譜純，甲酸作為分析純。

1.1 樣品的前處理

取超濃縮大蒜素片，將其研磨成粉，精確稱量8.0 g后倒入500 mL錐形瓶中，加入160 mL超純水，溶解搖勻，加入3至8滴濃度為50%的氫氧化鈉溶液，調節pH至7。將混勻的上述液體放入恒溫磁力攪拌水浴鍋中，設置溫度為60℃，轉速100 r/min，60 min 后，冷卻至室溫，再加入乙醇320 mL，充分搖勻。調節水浴鍋溫度到65℃，調節轉速為120r/min，加熱60 min，過程中，每隔5 min給錐形瓶開塞放氣。取出后，冷卻到室溫，使用布氏漏斗抽濾。取480 mL濾液放入1000 mL分液漏斗中，加入160 mL正己烷，緩慢振蕩混勻2 min后萃取。靜置后分層，若分層不明顯或者乳化層過厚，則滴入甲醇1～5 mL。待分層徹底后，取上層清液測定。重復以上操作獲得2份平衡樣品。

1.2 標準溶液的配制

取為濃度為85%的DADS和65%DATS適量，用正已烷配制1000 mg/L的DADS和DATS樣品。使用時用正己烷分別配制成1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L的一系列標準溶液。DATS分別配制1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的一系列標準溶液，置于4℃以下冰箱儲存備用。

1.3 色譜條件

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)為分離柱；以為甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例為(85:15:0.1)為流動相。流速為1.0 mL/min；檢測波長為225 nm；柱溫：25℃；進樣量：25 μL。

2 結果與分析

2.1 測定波長的選擇

為了確定DATS以及DADS的最大吸收峰，進行全波長掃描，波長在210nm和225 nm時有最大吸收峰，但考慮甲醇作流動相時，210nm波長甲醇的峰干擾很明顯，因此選擇225nm波長。

2.2 樣品溶劑的選擇

為了選擇更好的樣品溶劑，將研磨好的樣品分別用淋洗液(甲醇-水-甲酸，85∶15∶0.1)、甲醇和正已烷按1.1方法進行處理，再色譜分析。結果發現只有正已烷作溶劑時，DADS與DATS才出現色譜峰，淋洗液和甲醇作溶劑并不出峰。結果見圖1。實驗最后選用正已烷作為溶劑。

結果表明，DADS和DATS在甲醇和淋洗液定容的標準溶液中不存在出峰，在正己烷中有出峰。這可能是因為兩個物質不能溶于淋洗液和甲醇中，但卻能溶解在正己烷中。故只在正己烷中檢測到它們的出峰。

2.3 方法學考察

按1.3的色譜條件，分別進DADS和DATS系列樣品溶液。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，另取濃度為4.0 mg/LDADS和DATS分別進樣7次，計算方法的精密度。結果見表1。從表1可看出，方法可靠。

表1 線性方程、檢測限及相關系數

圖1 正己烷、淋洗液與甲醇作溶劑的色譜圖

2.4 樣品的測定及加標回收率

取按1.1 前處理方法處理好的樣品溶液進行色譜分析，典型的色譜圖見圖2。

圖2 DADS和DATS的色譜圖

對樣品進行加標處理后，加標回收率見表2。

表2 DADS和DATS的加標回收率和相對標準偏差

3 結論與討論

使用HypersiL ODS C18柱(4.6x250mm，5μm)為分離柱；以為甲醇、水和甲酸的混合溶液，比例為(85∶15∶0.1)為流動相，波長為225nm時，DADS和DATS獲得較好的分離，加標回收率實驗表明方法準確可靠，精密度較好，可應用于超濃縮大蒜素片中的DADS以及DATS的測定。