TSK凝膠色譜系統測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中的高分子雜質

王桂英 張紅梅 魏永濤 許愛華 崔 震 張守忠

(1.濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250102；2.山東省計量科學研究院，濟南 250014)

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀為阿莫西林鈉與克拉維酸鉀按標示量之比5∶1均勻混合制成的無菌粉末，目前已廣泛用于臨床，主要治療由產酶耐藥菌引起的呼吸及泌尿系統的感染。作為β-內酰胺類抗生素，過敏反應是其在臨床上不容忽視的問題[1，2]，文獻研究表明，藥物中存在的高分子雜質是引發各種速發型過敏反應的過敏原[3，4]，因此，控制該類制劑中的高分子雜質含量具有重要意義。注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀國內現行有效的質量標準是《中國藥典》2015年版二部，但未將高分子雜質納入質量標準。本試驗參考相關文獻[5-7]，建立了注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質的測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀( 美國安捷倫儀器有限公司)；賽多利斯ME5 BT125D電子天平[d=0.01mg]；阿莫西林對照品(批號130409-201512，含量86.9%)；克拉維酸對照品(批號130429-201708，含量95.1%)；乙腈為色譜純；其它試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

流動相為0.005 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)-乙腈(80:20)。色譜柱為TSK GEL 2500 PWXL(300 mm*7.8 mm,5 μm)，檢測波長254 nm，柱溫：25 ℃，進樣量20 μL，流速：0.5 mL·min-1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取供試品適量，加水溶解并稀釋制成含阿莫西林1.0 mg·mL-1的溶液。0.45 μm濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取阿莫西林對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并稀釋制成含阿莫西林10 μg·mL-1的溶液,作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

2.4 強制降解試驗

精密稱取注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀適量，按“2.2”項下方法配制成含阿莫西林鈉1.0 mg·mL-1的溶液，分別進行強酸(加0.1 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，室溫放置5 min)、強堿(加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置5 min)、強光(4500 lx，6 h)、高溫(65 ℃水浴加熱10 min)、氧化(加入1%雙氧水2 mL，放置5 min)等強制降解試驗，得各降解試驗溶液。精密量取上述各降解溶液各20 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。結果供試品經破壞后，高分子雜質均有增加，其中經氧化破壞后高分子雜質增加尤為明顯。結果表明，高分子雜質峰與主峰有效分離，本色譜系統專屬性良好。結果見圖1、圖2。

圖1 典型色譜圖A.供試液；B.阿莫西林對照品；C.克拉維酸對照品；D.溶劑

圖2 破壞降解試驗色譜圖A.強酸降解；B.強堿降解；C.強光降解；D.高溫降解；E.氧化降解；F.雙氧水溶劑

2.5 線性

精密稱取阿莫西林對照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋制成3.84、9.59、19.19、47.97、95.94 μg·mL-1系列濃度的對照品溶液。精密稱取克拉維酸對照品，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋制成4.04、10.11、20.22、50.54、101.09 μg·mL-1系列濃度的對照品溶液。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以阿莫西林鈉、克拉維酸鉀濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得阿莫西林回歸方程為y=6.02668x-0.165586(相關系數r=1.0000)，克拉維酸回歸方程為y=1.19874x+0.501622(相關系數r=0.99998)。結果表明，阿莫西林在3.84～95.94 μg·mL-1、克拉維酸在4.04～101.09 μg·mL-1濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.6 檢出限與定量限

分別將阿莫西林、克拉維酸對照品溶液逐級稀釋，記錄色譜圖，阿莫西林檢出限為0.24 μg·mL-1，定量限為0.80 μg·mL-1；克拉維酸檢出限為1.35 μg·mL-1，定量限為4.50 μg·mL-1。

2.7 精密度和重復性

精密吸取阿莫西林鈉對照品(9.59 μg·mL-1)、克拉維酸鉀對照品(10.11μg·mL-1)各20μL，按“2.1”色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖，峰面積的RSD分別為0.25%和0.47%，表明儀器精密度良好。

平行制備供試品溶液6份，按“2.1”色譜條件進樣分析，測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質的總量，平均結果為1.75%，RSD=0.8%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.8 穩定性

取供試品溶液，按“2.1”色譜條件，分別于 0、0.5、1、2、3 h 時進樣，計算得RSD=8.4%(n=5)，說明供試品不穩定，提示應臨用新制。

精密稱取克拉維酸鉀原料0.02 g，用水溶解配制濃度為含克拉維酸200 μg·mL-1的溶液，按“2.1”色譜條件，分別于 0、1、2、3、5 h時進樣，峰面積無顯著變化，說明克拉維酸鉀溶液5 h內基本穩定，對樣品高分子雜質的檢測結果計算無影響，故本實驗高分子雜質的結果按外標法以阿莫西林計算。

2.9 樣品測定結果

3家企業9批注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀，按“2.1”項下的方法進行測定，用外標法按阿莫西林計算高分子雜質的含量。結果見表1。高分子雜質含量平均值為1.46%。

表1 注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質含量情況

3 討論

3.1 磷酸鹽緩沖液濃度的選擇

流動相中磷酸鹽緩沖液的濃度最初考慮0.005、0.01、0.05 mol·L-13個方案，試驗發現濃度為0.005 mol·L-1時，主峰與相鄰雜質峰已能較好的分離，綜合考慮，選擇濃度較低的磷酸鹽緩沖液作為流動相。

3.2 耐用性試驗

通過改變波長±2nm、柱溫±5℃、pH±0.2來考察分析方法的耐用性，實驗結果表明，在波長、柱溫、pH等條件發生微小變化時，兩主峰與相鄰雜質峰均能良好分離，說明本方法耐用性較好。

3.3 結論

本試驗建立了一種檢測注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中高分子雜質的TSK凝膠色譜法，并對方法進行了評價，試驗表明該方法操作簡便，靈敏度高，重現性好，為LC-MS鑒別注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中的高分子雜質分析奠定了基礎，也為制劑的質量研究提供參考。