基質(zhì)分散固相萃取-UPLC-MS/MS測(cè)定煙草中馬來(lái)酰肼殘留量

張海燕 陶曉秋 韶濟(jì)民 靳冬梅 龐 夙 熊 巍

(四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，成都 610041)

馬來(lái)酰肼又名抑芽丹，是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，煙草生產(chǎn)中常用其抑制煙草側(cè)芽生長(zhǎng)，國(guó)外應(yīng)用比較廣泛。由于其在煙草大田生長(zhǎng)期的多次施用，從而會(huì)導(dǎo)致其在初烤煙葉中的殘留, 煙葉中馬來(lái)酰肼的殘留會(huì)對(duì)吸煙者產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)在2013年修訂的煙草農(nóng)藥指導(dǎo)性殘留限量名單[1]中，馬來(lái)酰肼的指導(dǎo)限量為80 mg/kg。

煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的分析方法主要有分光光度法(ISO4876-1980)[2]，高效液相色譜法(HPLC，YC/T405.5—2011)[3]、氣相色譜法(GC)和膠束液相色譜(MLC)。煙草行業(yè)目前應(yīng)用較為廣泛的測(cè)定煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的方法為HPLC-UV法(YC/T405.5—2011)，該方法對(duì)樣品采用鹽酸溶液加熱回流萃取，用C18固相萃取小柱凈化，HPLC-UV測(cè)定。該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限較高，且采用外標(biāo)法定量，對(duì)煙草中低濃度馬來(lái)酰肼殘留量的檢測(cè)準(zhǔn)確度相對(duì)較低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性檢出現(xiàn)象。陳曉水[4]等建立了一種鹽酸溶液加熱回流萃取后經(jīng)水相濾膜過(guò)濾，氘代同位素內(nèi)標(biāo)定量，LC-MS/MS法測(cè)定煙草中馬來(lái)酰肼的方法，方法的檢測(cè)靈敏度顯著提高，但是分析時(shí)間為30 min，大量樣品的檢測(cè)會(huì)受到一定的限制。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC)[5-7]具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于煙草樣品中低殘留量的馬來(lái)酰肼的快速準(zhǔn)確測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用加熱回流法提取煙葉中的馬來(lái)酰肼，分散固相萃取法凈化樣品，UPLC-MS/MS測(cè)定，氘代內(nèi)標(biāo)定量，適合于準(zhǔn)確快速分析煙草中馬來(lái)酰肼的殘留量。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Xevo TQ，美國(guó)Waters公司)，配備電噴霧電離源(ESI)；智能型加熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；渦旋振蕩器(Vortex Mixer 230 V-EU 振蕩器，美國(guó)Labnet 公司)； AE200 電子分析天平(感量：0.0001 g，瑞士Mettler Toledo 公司)；Cascada ANMK2 純水儀(美國(guó)Pall 公司)；0.45 μm 水相針式濾器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；單孔道移液器(20～200 μL)、電動(dòng)分液器(德國(guó)Eppendorf 公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo-Fisher公司)；馬來(lái)酰肼標(biāo)準(zhǔn)品(化學(xué)純度：≥98.5%，德國(guó)Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)，馬來(lái)酰肼-d2標(biāo)準(zhǔn)品(化學(xué)純度：98%，同位素純度：98.9%德國(guó)Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers)；N-丙基乙二胺(PSA)購(gòu)自安捷倫公司(美國(guó))，石墨化炭黑、弗羅里硅土，鹽酸(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；甲酸(HPLC級(jí)，濃度為49～51%，德國(guó)Sigma公司)；水為超純水。無(wú)農(nóng)藥殘留煙葉樣品由國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取10 mg馬來(lái)酰肼標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.0001g, 用超純水溶解并定容至10 mL，制得1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取一定量的所述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確配置1.0 mg/mL馬來(lái)酰肼-d2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于棕色玻璃瓶中。取一定量的所述內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用超純水稀釋定容，制得200 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液。所有的儲(chǔ)備液和工作液于冰箱4℃保存，使用前將其恢復(fù)到室溫。

1.4 樣品的提取

稱(chēng)取5 g試樣于圓底燒瓶中，精確至0.01g。加入50 mL 4 mol/L的鹽酸提取液，250 μL氘代內(nèi)標(biāo)工作液(200 μg/mL)，適當(dāng)振搖，使煙末分散與鹽酸溶液混合均勻。將燒瓶放置于加熱套中，裝上球形冷凝管，將加熱套溫度設(shè)置為180℃左右，加熱回流。控制回流速度，使蒸汽升至球形冷凝管第二球處，回流穩(wěn)定后開(kāi)始計(jì)時(shí)，回流1小時(shí)。回流結(jié)束后，關(guān)閉加熱套或油浴鍋電源，冷卻至室溫。

1.5 分散固相萃取凈化

移取1mL上清液于旋蓋離心管，加入25 mgPSA吸附劑，漩渦振蕩混合2 min，2000 r/m，吸取上清液經(jīng)水相濾膜過(guò)濾，移取500μL濾液，并用超純水稀釋定容到1mL后待測(cè)。

1.6 LC-MS/MS條件

1.6.1 LC條件

色譜柱:Atiantis UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1mm，1.8 μm； Waters公司)；流動(dòng)相：A為0.1%的甲酸水溶液(v/v)， B為0.1%的甲酸乙腈溶液(v/v)；流速0.45 mL/ min；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，100%A；2～2.8 min，100%A～30%A；2.8～3.0 min，30%A～20%A；3.0～4.0 min，20%A～5%A；4～6 min，5%A；6～6.1 min，5%A～100%A；6.1～8 min，100%A。

1.6.2 MS/MS條件

電噴霧離子源；正離子掃描模式；噴霧電壓(IS)：3.0 kV；離子化溫度500 ℃；霧化氣流量：800 L/Hr; 錐孔氣(cone)流量50 L/Hr; 碰撞氣流量為0.15 ml/ min; 碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)? 駐留時(shí)間為100 msec，正離子MRM模式采集。監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其相應(yīng)的碰撞能量(CE)見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下馬來(lái)酰肼及其氘代內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果

2. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

為了減少基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的離子抑制或增強(qiáng)作用對(duì)定量分析的影響，采用空白樣品提取液配制一系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別移取標(biāo)準(zhǔn)工作液5 μL，12.5 μL，50 μL，125 μL，250 μL和500 μL標(biāo)準(zhǔn)工作液到7個(gè)10mL棕色容量瓶中，每個(gè)容量瓶移入25 μL內(nèi)標(biāo)工作液(200μg/mL)，配制成溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法為分別移取500 μL每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液于7個(gè)1.8mL旋蓋色譜瓶，加入500 μL空白煙葉樣品萃取液，用超純水定容至1mL，馬來(lái)酰肼的線性范圍50 ng/mL-5000 ng/mL。分別對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，并對(duì)各標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值(y)和其濃度(x)進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以3倍信噪比確定方法的檢出限，各種煙葉基質(zhì)中馬來(lái)酰肼的LOD范圍為0.624～987 ng/mL，混合標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 1個(gè)曬煙樣品的選擇離子流色譜圖

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)一般是通過(guò)基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來(lái)評(píng)價(jià)[8]。一般認(rèn)為，ME值在85% ～115% 之間不存在基質(zhì)效應(yīng)。具體計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。

ME= ( 1-X2 /X1 ) ×100%

(1)

其中，ME代表基質(zhì)效應(yīng)，X1 和X2 分別代表溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙葉基質(zhì)對(duì)曬煙和烤煙中馬來(lái)酰肼的基質(zhì)效應(yīng)分別為88.50%和88.47%( 根據(jù)表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)計(jì)算)，可見(jiàn)煙葉基質(zhì)對(duì)馬來(lái)酰肼的響應(yīng)強(qiáng)度產(chǎn)生了很大的抑制作用，但基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線仍可獲得與溶劑空白標(biāo)準(zhǔn)曲線相似的線性響應(yīng)( r2，見(jiàn)表2) 。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定量，以避免基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。

表2 馬來(lái)酰肼的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

2.3 方法的回收率及重復(fù)性

選取不含馬來(lái)酰肼的烤煙和晾曬煙葉樣品，向不同類(lèi)型的煙葉樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照“樣品的提取和凈化”的方法處理樣品后上機(jī)檢測(cè)，然后分別計(jì)算烤煙和晾曬煙樣品中馬來(lái)酰肼的回收率。每個(gè)水平測(cè)5次，得出平均回收率(表3)。如表3所示，馬來(lái)酰肼平均回收率在105.9～111.8%之間，RSD范圍為3.3%～9.1%。結(jié)果表明，方法的重復(fù)性和回收率均符合歐盟委員會(huì)[9]“食品和飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法評(píng)價(jià)指導(dǎo)文件”的相關(guān)要求(回收率在70%～120%，重復(fù)測(cè)定RSD<20%)

表3 煙草中馬來(lái)酰肼的回收率和精密度(n=5)

3 討論

3. 1 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動(dòng)注射方式進(jìn)樣進(jìn)行母離子掃描，確定最大響應(yīng)值的母離子，在子離子掃描(PI)模式下，調(diào)整CE找到該母離子對(duì)應(yīng)的子離子，其中響應(yīng)最高的錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

馬來(lái)酰肼在反相柱上有較好的保留行為，因此本實(shí)驗(yàn)選取了UPLC HSS T3，Hypercarb Porous Graphitic Carbon，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等色譜柱優(yōu)化條件發(fā)現(xiàn)，采用UPLC HSS T3柱分離的峰性尖銳，對(duì)稱(chēng)，分離度明顯優(yōu)于其它色譜柱，能夠?qū)ⅠR來(lái)酰肼和基質(zhì)中的干擾物完全分離，適合于不同類(lèi)型的煙葉中馬來(lái)酰肼殘留量的測(cè)定。圖1是1個(gè)馬來(lái)酰肼有檢出的曬煙樣品的MRM色譜圖。

本實(shí)驗(yàn)選取在水中加入甲酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)、乙酸(0.1%；0.2%；0.5%和1%)或者甲酸銨(5 mmol/L和10 mmol/L)作為流動(dòng)相A進(jìn)行優(yōu)化色譜條件。結(jié)果表明，在水中添加0.1%的甲酸作為流動(dòng)相A時(shí)分析物的質(zhì)譜信號(hào)最強(qiáng)，峰形最好，所以最終選擇0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相A。梯度洗脫程序僅需8 min，與標(biāo)準(zhǔn)方法(20 min)相比顯著縮短了分析時(shí)間。

3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化：

分散固相萃取技術(shù)具有快速、高效和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于殘留檢測(cè)的前處理中。它主要通過(guò)非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質(zhì)干擾成分，進(jìn)而達(dá)到凈化的效果[10]。常用的吸附劑材料有無(wú)水MgSO4、弗羅里硅土、PSA 和石墨化碳黑(GCB)。本實(shí)驗(yàn)考察了PSA、石墨化炭黑、弗羅里硅土幾種凈化劑對(duì)煙草中馬來(lái)酰肼提取效率的影響。

由圖2中結(jié)果可見(jiàn)，PSA對(duì)馬來(lái)酰肼提取效率最高，因?yàn)镻SA吸附劑在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團(tuán)，主要作用力是極性相互作用及弱陰離子交換作用，可有效去除樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖等干擾物，但對(duì)分子結(jié)構(gòu)中帶有羧基的化合物有一定的保留作用，所以本實(shí)驗(yàn)選用PSA作為前處理的凈化劑。

圖2 不同凈化劑對(duì)煙草中馬來(lái)酰肼的提取效率

3.3 實(shí)際煙葉樣品檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比

利用該方法與標(biāo)準(zhǔn)方法(YC/T405.5-2011)同時(shí)對(duì)20個(gè)煙葉樣品進(jìn)行檢測(cè)，并且對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖3。

圖3 UPLC/MS-MS法與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)馬來(lái)酰肼殘留量的相關(guān)性

由圖3中相關(guān)性結(jié)果可以看出，本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)煙葉中馬來(lái)酰肼殘留量的相關(guān)系數(shù)R2=0.9894，則r=0.9947(r0.01=0.561，n=20)。r> r0.01，表明兩種分析結(jié)果達(dá)到了極顯著的正相關(guān)，其趨勢(shì)線的斜率為0.998，接近1，兩種方法的測(cè)定值無(wú)顯著差異，具有較好的一致性。

4 結(jié)論

建立了煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的準(zhǔn)確快速分析方法，采用基質(zhì)分散固相萃取處理煙葉樣品，氘代內(nèi)標(biāo)定量，UPLC-MS/MS分析檢測(cè)，總分析時(shí)間為8 min，各種煙葉基質(zhì)中馬來(lái)酰肼的檢出限范圍為0.624～987 ng/mL，加標(biāo)回收率為105.9%～111.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～9.1%。本實(shí)驗(yàn)田建立的方法具有針對(duì)性強(qiáng)，檢測(cè)時(shí)間短和靈敏度高的特點(diǎn)，能夠很好的應(yīng)用于煙草中馬來(lái)酰肼殘留量的快速分析檢測(cè)。