牛早期妊娠診斷的研究進展

郭騰龍，汝振遠，任尚，楊賢樹，張翔棟，申屠璐燕，張運海，曹祖兵

(安徽農業大學動物科技學院/地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

隨著我國經濟的快速發展，人民生活水平不斷提高，牛肉、牛奶等產品以其口感佳、營養高等優點受到大家的青睞，人民對牛肉、牛奶的需求日益增多。以前傳統、落后、粗放的養殖模式已不能滿足行業的需求而逐漸被淘汰并轉變為規模化、標準化、精細化、產業化的養殖模式，通過不斷優化飼養方式以及推廣應用先進養殖技術，提高母牛的繁殖效率[1]。

母畜繁殖效率是影響養殖業經濟效益的關鍵因素。相對于豬、羊等家畜，牛的產犢間隔長、產犢少，繁殖效率低，飼養成本高，所以提高母牛繁殖效率對于養牛行業尤為重要。制約母牛繁殖效率的因素有很多，諸如產犢間隔、配種技術、營養供給、養殖環境、管理水平、疾病防控等，其中受產犢間隔的影響最大，而配種后的早期診斷能有效縮短產犢間隔，提高母牛繁殖效率[2]。

早期妊娠診斷是在動物配種后3個月內，通過外部觀察行為表現,或者測定體內生殖相關標志物的水平來判斷母畜是否妊娠。配種后的母牛進行早期妊娠診斷，對已經確認妊娠的母牛進行精細化管理，滿足母體自身和胎兒的營養需求，保證母牛能夠正常的產犢和哺乳；而對未妊娠的母牛，應找出原因后及時進行第2次配種，并且淘汰多次配種后仍妊娠失敗的母牛[3]。不及時或不準確的妊娠診斷都會導致母畜產犢間隔的延長，一頭成年母牛每錯過一個發情周期(平均21 d)，將增加70～114美元的非繁殖期飼養成本，而失配13.5個發情周期(大概283 d)，相當于損失一頭牛犢以及這一泌乳期的泌乳量(荷斯坦牛一個泌乳期產奶3 000～5 000 kg)，這也進一步說明早期妊娠診斷是影響養殖效益的關鍵環節[4]。因此，養殖人員掌握準確的早期妊娠診斷方法是至關重要的，早期妊娠診斷旨在配種后能盡早區分妊娠母牛以便進行精細化管理，同時還能在診斷過程中發現母牛的一些生殖疾病，進行及時治療能有效的減少妊娠母牛的流產風險，極大提高母牛的繁殖效率。

在妊娠初期，由于胎兒和胎盤的相互作用，母牛體內發生一系列新陳代謝的變化，導致妊娠母牛和空懷母牛的一些生理和生化指標存在一定的差異，例如生殖器官的功能、孕酮(progesterone，P4)、早孕因子(early pregnancy factor，EPF)、妊娠相關糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins，PAGs)、干擾素tau(IFN-τ)、體溫以及行為等方面[5-6]。人們基于這些指標的差異，開發出許多早期妊娠診斷方法，例如直腸觸診、超聲波診斷、檢測牛血中PAGs含量的早期妊娠診斷試劑盒、血小板計數法等。這些方法各有千秋，但總體都不太完善，存在診斷準確率低、操作繁瑣、成本較高等現實問題，難以滿足當今養牛行業的需求。因此，開發出一個準確、高效、低成本的早期妊娠診斷方法，對于養牛行業來說尤為重要。

早期妊娠診斷在養牛業應用最為廣泛，技術也相對比較成熟，主要分為臨床診斷和免疫學診斷，其中臨床診斷是通過檢查母體中胎兒、胎膜和羊水的存在狀態來進行診斷，主要方法有直腸觸診、超聲波檢查法等；免疫學診斷則通過檢測P4、PAGs和EPF在妊娠早期母牛的血液、尿液和乳汁中的濃度變化，來判斷母牛是否妊娠，主要檢測方法有放射免疫法(RIA)、膠體金免疫檢測技術(GICT)和酶聯免疫法(ELISA)等[7-8]。

1 臨床診斷

1.1 直腸檢查

黃體是卵泡細胞所形成的暫時性內分泌器官，主要功能是分泌P4，維持妊娠。妊娠初期形成的妊娠黃體，形狀略大于周期黃體，柔軟光滑，妊娠中期和后期則較硬[9]。子宮在植入受精卵后，其子宮角會隨著胚胎的發育產生相應的變化，呈不對稱的發展趨勢，植入受精卵的一側子宮角要比未植入的大，并且在妊娠中后期有較為明顯的波動[10]。

牛的直腸觸診從首次提出到現在，已將近有兩百多年的歷史，目前仍是一些大型家畜妊娠診斷的主要方法。在人工授精50 d之后，通過觸摸母牛卵巢黃體和子宮角形狀、大小以及質感的變化，能對母牛是否妊娠作出較為準確的判斷[11]。由于診斷過程中可能會引起母牛應激，經直腸觸診是否會造成母牛的流產這個問題一直存在爭議，然而研究表明，經直腸觸診和和胎膜滑動技術并不會增加妊娠奶牛流產風險，前提是在專業的獸醫以及嚴格規范的操作技術下進行[12-13]。雖然這種方法有著診斷成本低、準確率高等優點，但僅能用于人工授精后45～60 d的妊娠診斷，很難在配種后一個情期(約21 d)進行準確診斷，且操作復雜，會因為一些生殖疾病造成誤診，例如子宮積水或者子宮蓄膿等，如果操作不慎還會造成胚胎損失，增加母牛醫源性流產的風險，所以需要技術員有豐富的操作經驗[14]。

1.2 超聲波診斷法

超聲診斷法有超聲多普勒檢查法(D超)、幅度調整型超聲診斷法(A超)、實時超聲顯像法(B超)，其中 D超準確率最高，但價格極其昂貴，A超操作復雜且準確率并不理想，所以前兩者逐漸被市場淘汰，目前用的最廣泛的還是B超[15]。B超在妊娠診斷有體外探查法、陰道檢查法和直腸檢查法，對于奶牛這種體型大、被毛較多的家畜，主要采用直腸檢查法進行早期妊娠診斷[16]。通過探頭檢測回聲信號，并把這種信號以光點明暗的形式從對應的顯示器中顯示出來，回聲信號越強，光點越亮，反之則越暗[17]。羊水是一種均勻的介質，不會反射超聲波，超聲圖像呈小圓形的液性暗區，壓迫時變形，所以利用B超進行妊娠診斷主要是觀察母牛羊水狀態，必要時再檢查卵泡和黃體，當超聲波穿過母牛子宮時，顯示器會顯示各層面的的切面圖像，根據顯示器光點明暗差異來判斷母牛是否妊娠[18]。賈國慧等[19]利用B超在奶牛妊娠26～28 d時進行妊娠診斷，準確率可達到90.48%。同時，利用B超還可以對母牛卵巢疾病進行輔助診斷，例如根據奶牛卵巢和子宮的回聲狀態來判斷卵巢囊腫、持久黃體以及排卵延遲等，有效的提高生殖疾病的診斷率。盡管B超檢查有著準確率高、操作方便等優點，但仍受到價格昂貴的約束，診斷成本偏高，中小型的養牛場很難配備牛用B超儀。

2 免疫學診斷

2.1 孕酮(P4)檢測

整個妊娠期，奶牛血液和乳汁中都能檢測到較高水平的P4，妊娠初期由黃體分泌，而妊娠中后期則是由胎盤的滋養層細胞分泌，因此P4含量可以用來作為判斷母牛是否妊娠的重要依據[20]。劉瑞生[21]發現奶牛乳汁比血液中的P4含量高，并且取樣更為方便，因此常測定乳汁中的P4含量來測定奶牛是否妊娠。常用放射免疫法(RIA)、酶聯免疫法(ELISA)等方法測定奶牛乳汁孕酮(MP4)。

RIA是一種將放射性同位素的測量與免疫反應相結合的方法。在該方法中，放射標記抗原(抗體)與相應的抗體(抗原)結合，然后測定抗原-抗體結合物的放射性，并用于測定牛奶中孕酮的濃度。陳海燕等[22]用RIA法測定妊娠與非妊娠奶牛MP4含量，發現妊娠牛MP4含量從7～9 d開始極顯著高于未妊娠牛(P<0.01),并隨著時間增加, 差異持續增大。RIA測定奶牛MP4高效、準確和快速，但因其技術和設備要求較高，且有放射性傷害，因此一般不適合在牛場中使用。

ELISA結合了生物酶高效催化反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性，用于檢測妊娠相關激素。當用標記有生物酶的抗體在牛奶中檢測到抗原(P4)時，這種酶會與四甲基聯苯胺(TMB)發生反應，導致牛奶變色，根據顏色的深淺推斷P4濃度[23]。據此，現已開發出高效、快速的ELISA試劑盒。吳凌等[24]自制奶牛乳汁孕酮ELISA試劑盒，通過測定配種后19～23 d奶牛MP4濃度來進行妊娠診斷，陽性和陰性準確率分別達到93.3% 和95.8%。盡管ELISA試劑盒能在奶牛一個情期內作出較為準確的妊娠診斷，但其價格昂貴、試劑保存時間短，因而限制了該方法的廣泛應用。

2.2 早期妊娠因子(EPF)檢測

EPF又稱早期妊娠因子，是一種妊娠依賴性多分子蛋白復合物，首次發現于大鼠血清中[25]。EPF在胚胎發育過程中作為滋養層自分泌和旁分泌的免疫耐受因子，在母體中發揮免疫調節作用，抑制母體對胎兒的免疫排斥并維持妊娠[26]。此外，奶牛在受精24 h后乳汁和血清中都能檢測到EPF，一旦終止妊娠24～48 h之后，EPF將迅速消失，所以EPF在奶牛乳汁和血清中的變化可以用于早期妊娠診斷和監測早期胚胎的狀態[27-28]。但是Cavanagh[29]認為，EPF不是胎盤特異性蛋白，腫瘤以及轉化的細胞系均可引起EPF的釋放，通過檢測EPF來進行早期妊娠診斷可能出現假陽性結果，因此該方法僅適用于具備特定條件的實驗室，并不適合作為養殖場常規檢測手段。EPF常用玫瑰花環抑制試驗和硫酸銅檢測法等進行測定。

玫瑰花環抑制試驗(rosette inhibition test，RIT)，其原理是在補體的作用下，EPF可以抑制T淋巴細胞與異種紅細胞凝集形成玫瑰花樣細胞團(玫瑰花環)，玫瑰花環的抑制滴度，即R值，可以間接檢測血清EPF含量[30]。Ghaffari等[31]研究表明，當R值高于8時，可認定為懷孕，當R值低于4時則認定為未懷孕，如果R值在4～8之間，則需要重新檢測。賀加雙等[32]利用RIT法檢測不同孕期(1～9月)肉牛血樣，在配種后1個月左右，妊娠母牛和未妊娠母牛R值便出現差異顯著(P<0.05)，且結果與Ghaffari一致。RIT能在母牛受精后24 h后，便可通過檢測血清EPF進行妊娠診斷。但需要注意的是，該方法是根據檢測免疫抑制活性，間接反應EPF的存在，檢測結果受多種因素影響，而且該法操作繁瑣、檢測周期長，因此不適合作為一種常規的早期妊娠診斷方法。

硫酸銅法是利用硫酸根離子與EPF反應產生凝集的特性，對牛乳中的EPF進行定性分析，妊娠母牛乳汁中含有高濃度的EPF，能與硫酸銅反應產生云霧狀沉淀，故而能作為一種早期妊娠診斷的方法。李青旺等[33]用硫酸銅法對57頭黑白花母牛進行早期妊娠診斷，并通過直腸檢查進行確診，發現3%的硫酸銅對妊娠31～50 d的中午乳樣檢測精度最高，平均陽性率達到90.35%。該方法準確率高、操作簡便，但其只適合于哺乳期奶牛，而且需要肉眼觀察，診斷結果容易受到主觀因素影響而降低可靠性。

2.3 妊娠相關蛋白(PAGs)檢測

PAGs是胎盤滋養層雙核細胞與母體子宮上皮細胞融合時，合成并分泌的一類特異性糖蛋白，在反芻動物妊娠過程中起著維持妊娠和免疫調節的作用，1982年Butler等首次從妊娠母牛的胎盤膜中分離出來PAGs[34]。妊娠期間，奶牛的乳汁和血清中均可檢測到PAGs，并且PAGs濃度在受精后第25天開始逐漸升高，在第32天達到一個峰值，血清中的PAGs含量約為乳汁中的2倍[35]。然而，Commun等[36]利用ELISA法對妊娠奶牛進行妊娠診斷，結果顯示乳汁和血清中PAGs濃度檢測精度并無顯著差異。另外有研究指出，在妊娠第31天，根據母牛體內PAGs的濃度變化，可以預測妊娠31～59 d內胚胎的死亡率，也就是說PAGs不僅可以作為早期妊娠診斷的標志物，還可以作為預測胚胎死亡的模型[37]。

PAGs檢測法與EPF檢測法存在相同的缺陷，即只能在特定實驗室條件下進行，且PAGs檢測法的技術要求和檢測成本都要高于EPF檢測法。然而隨著研究的不斷深入，近些年來出現了許多商業的PAGs檢測試劑盒，在保持其高準確率的條件下不斷優化檢測技術，更加高效的PAGs檢測技術指日可待。

2.4 IFN-τ檢測

IFN-τ是一種新型I型干擾素，不僅具有I型干擾素的共同特征，如預防病毒感染、抑制細胞增殖等，還是一種反芻動物特有的妊娠識別信號，在牛妊娠14 ～25 d時由滋養層細胞分泌，主要作用是通過阻礙前列腺素2α(PGF2α) 釋放來阻止黃體溶解，使P4持續分泌，并參與胚胎著床、胚胎建立等重要過程[38-39]。其作用類似于人絨毛膜促性腺激素(hCG)，因此可以用于反芻動物的早期妊娠診斷[40]。王曉艷[41]研究發現，IFN-τ通過與特定的miRNA互作來調節妊娠早期奶牛子宮內膜牛白細胞Ⅰ類抗原(BoLA-Ⅰ)的表達，進而減少母體對胎兒的免疫排斥，增加胚胎植入的成功率。朱喆[42]利用qPCR和Western blot技術對妊娠9～20 d的奶牛子宮內膜組織進行分析，發現相較于未妊娠奶牛，妊娠早期奶牛子宮內膜組織的IFN-τ轉錄水平顯著升高。Green等[43]檢測妊娠與未妊娠奶牛外周血白細胞干擾素tau刺激基因(ISGs)的表達，發現在妊娠18 d(約1歲)的初產母牛中，ISGs的表達顯著增加，但是年齡較大的奶牛，在妊娠18 d時對ISG診斷的敏感性較低。Yoshino等[44]通過檢測外周血白細胞ISGs的表達豐度，對受精3周的日本黑牛進行早期妊娠診斷，陽性診斷準確率和陰性診斷準確率分別為80%和94.6%。

Ahmad等[45]通過中性粒細胞裂解物ELISA檢測表明，妊娠牛血清ISG濃度顯著高于非妊娠牛，且在妊娠16 d時差異性最高，因此干擾素tau檢測法有望能在母牛配種后16 d進行早期妊娠診斷。IFN-τ在反芻動物妊娠診斷上的研究才剛剛起步，相比于其他的免疫學診斷，干擾素tau 在牛早期妊娠診斷上的報道少之又少，將來隨著研究的深入，干擾素tau檢測法可能會像PAGs檢測法一樣，成為一種熱門的牛早期妊娠診斷技術。

3 展望

妊娠期間，胎兒與母體發生一系列互作，導致妊娠母牛與未妊娠母牛體內生理生化指標產生顯著差異，基于這些差異建立了多種早期妊娠診斷方法，但都不能滿足當代養牛業的需求。直腸觸診需要豐富的臨床經驗，易造成誤診，且診斷時間晚，無法在配種后18～21 d內作出準確診斷；超聲波診斷不僅需要熟練的操作技術，還受到儀器設備昂貴的限制；免疫學診斷大都存在操作復雜、耗時長或有放射性危害等缺陷，很難在養殖場內推廣使用。開發出一個理想化的母牛早期妊娠診斷方法是畜牧研究者關注的熱點話題，近年來，互聯網+農業模式飛速發展，畜牧養殖業越來越智能化，機電傳感和遙感技術也被應用于畜牧領域，根據母牛配種后的行為、溫度、體重等生理變化進行早期妊娠診斷是未來的一個趨勢，其優點在于不必接觸母牛便可進行早期妊娠診斷，這種自動化的診斷方法既不會對胎兒造成損害又減少了母體的應激，同時還可以準確的監測返情，進一步提高母牛的繁殖效率[46]。另外，隨著高通量測序技術的發展，越來越多的妊娠相關因子(如血清外泌體miRNA等)被發掘出來，這些生物標識物不僅能預測妊娠，還與一些疾病密切相關，因此通過檢測妊娠相關標識物進行早期妊娠診斷會有很大的學術價值與應用前景[47]。