致奶牛乳房炎大腸桿菌免疫生物學特性

嚴 勇，李新圃，丁學智，嚴作廷，王勝義，武小虎，李宏勝，王旭榮 (中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農業部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎是奶牛常見的三大疾病之一，不僅能導致乳產量和質量的下降，還會增加治療費用，嚴重的還會造成奶牛淘汰和死亡，給奶牛養殖業造成巨大的經濟損失[1-2]。隨著我國奶牛集約化養殖模式的推廣及對奶牛乳房炎防控水平不斷的提高，乳房炎致病菌種類和菌群發生了變化，環境性病原菌，尤其是大腸桿菌的檢出率呈逐年升高趨勢[3]。大腸桿菌一般造成奶牛全身性的急性臨床型乳房炎，在分娩前后和泌乳早期較易感染，即使治愈后大腸桿菌被完全清除，對乳腺組織造成的損傷仍需要很長時間才能恢復，使乳產量和質量很難恢復到發病前的正常水平[4]。牛場糞便中滋生的大腸桿菌，是引起奶牛乳房炎的主要傳染源，因此，加強環境衛生是控制大腸桿菌性奶牛乳房炎發生的有效措施。近年來，在治療中由于抗生素的大量使用及不規范濫用，造成大腸桿菌耐藥性呈逐年增多趨勢，而且多重耐藥性嚴重，給大腸桿菌性乳房炎的治療帶來困難[5-6]。為了有效防控大腸桿菌性奶牛乳房炎，國內外學者開展了長期廣泛的研究，但由于乳房炎大腸桿菌致病及耐藥機理復雜，血清型繁多，不同地區及牛場優勢血清型又不一樣，給治療藥物及疫苗研究帶來巨大的挑戰。本研究對乳房炎大腸桿菌的致病性、致病因子、血清型、耐藥性、耐藥機制及防控策略進行綜述，以期為今后更好的防控大腸桿菌性奶牛乳房炎提供參考。

1 奶牛乳房炎大腸桿菌的致病性研究

大腸桿菌是引起奶牛乳房炎常見的病原體之一，通常引起奶牛全身性急性臨床型乳房炎。大腸桿菌性乳房炎在奶牛分娩前后和泌乳早期的發病率較高，臨床癥狀變化范圍很大，從明顯的局部乳房癥狀到嚴重的全身性臨床反應，嚴重影響高產奶牛的生產力[7]。近年來，隨著奶牛集約化養殖模式推廣，規范化擠奶程序、干奶期治療和現代化管理方式的應用，傳染性乳房炎病原菌的檢出率有所下降，而環境性乳房炎病原菌，特別是大腸桿菌的檢出率呈現增多趨勢[3]。RIEKERIN等[8]對加拿大10省份106個奶牛場采集的3 033份乳房炎奶樣進行細菌分離鑒定，結果大腸桿菌的檢出率占到整個檢出病原菌的第2位，高達17.6%。涂軍[9]采集廣西南寧地區臨床型乳房炎奶樣156份，采用生化鑒定方法進行了細菌分離鑒定、檢出6種156株病原菌，其中大腸桿菌檢出率最高，高達46.8%(73/156)。GAO等[10]對從甘肅、內蒙古、黑龍江、廣西以及中國東部地區共161個大型奶牛場采集的3 288份臨床性乳房炎牛奶樣本進行細菌分離鑒定，結果大腸桿菌檢出率最高(檢出473株)，占病原菌總數的14.4%。張莉莉[11]對甘肅、寧夏、青海和內蒙古的12個奶牛場采集的202份奶牛乳房炎牛奶樣本，采用16S rDNA測序方法進行了細菌分離鑒定，結果鑒定出3種病原菌，其中大腸桿菌檢出率最高(34.4%)。李麗好[12]對河北地區采集的159份奶牛乳房炎奶樣進行細菌分離、采用生化和PCR鑒定方法，鑒定出3種96株病原菌，其中大腸桿菌17株，檢出率為17.7%。大量研究顯示，奶牛大腸桿菌性乳房炎發病率的高低與牛場環境衛生的好壞及管理水平有直接的關系，因此，為了降低大腸桿菌性奶牛乳房炎發病率，應加強環境衛生管理，尤其是在梅雨季節要及時清理運動場糞便，定期對運動場用燒堿及消毒液進行消毒，減少環境病原菌滋生。

2 奶牛乳房炎大腸桿菌致病因子研究

大腸桿菌的致病力跟其攜帶的毒力因子相關，腸道外致病性大腸桿菌的致病因子主要包括Ⅰ型菌毛、脂多糖(LPS)和鐵攝取等。

2.1 Ⅰ型菌毛Ⅰ型菌毛是腸桿菌中最常見的黏附因子，呈管狀螺旋結構，由主要結構亞基FimA和次要結構亞基FimF、FimG、FimH蛋白構成。從結構上看FimG和FimF亞基將FimH與FimA連接，連接順序依次為FimA-FimF-FimG-GimH。Ⅰ型菌毛能夠結合多種真核細胞，主要是由于FimH能識別甘露糖受體，FimH還能促進黏附、內化和形成胞內聚合物的作用。Ⅰ型菌毛能夠黏附非物體表面，這對生物被膜的形成有促進作用，使大腸桿菌在外界環境中更具有選擇優勢。

2.2 LPSLPS是大腸桿菌特有的成分，由類脂A、核心多糖、O抗原組成。LPS在細菌增值或裂解過程中釋放出來，引起宿主炎癥反應，大腸桿菌性奶牛乳房炎所表現出來的臨床癥狀部分原因主要是由于LPS的致病作用。O抗原是大腸桿菌血清型分型的依據，類脂A是LPS的生物活性成分，當在細菌表面暴露時，由巨噬細胞介導，表現出免疫原性。LPS誘導奶牛乳房炎的炎癥反應，引起中性粒細胞遷移。類脂A引起乳房炎的全身癥狀，如發熱、脫水、減少泌乳量和減緩瘤胃蠕動等。

2.3 鐵攝取鐵是細胞新陳代謝和生長發育所必需的元素，宿主體內鐵離子大多數都是與循環蛋白結合，如轉鐵蛋白、血紅素和乳鐵蛋白等。大腸桿菌攝取鐵的機制有兩種，即產生溶血素和生成鐵結合性復合物，其致病性的強弱與從宿主攝取鐵的能力直接相關。

通常根據毒力因子與致病過程，將對人和動物有致病性的大腸桿菌分為不同的致病類型。有人提出，將引起奶牛乳房炎的大腸桿菌作為一種新的致病類型，但大腸桿菌的毒力因子對奶牛乳房炎和臨床嚴重程度的影響尚未完全闡明。自20世紀70年代，人們一直研究致病性大腸桿菌對奶牛乳房炎的影響。研究顯示，從復發性奶牛乳房炎中分離的大腸桿菌表現更強的致病性和侵襲力。引起奶牛乳房炎的大腸桿菌比共生菌繁殖速度更快，抗中性粒細胞吞噬的能力更強[13]。BURVENICH等[14]研究結果顯示，牛源大腸桿菌引起的奶牛乳房炎的嚴重程度，主要取決于奶牛自身抵抗力，而不是大腸桿菌的致病性。KEMPF等[15]對引起奶牛乳房炎的大腸桿菌基因組與其他動物致病性大腸桿菌進行比較，結果顯示，引起奶牛乳房炎大腸桿菌攜帶的毒力基因很少，缺乏目前發現的真正毒力基因。LEIMBACH等[16]對奶牛乳房炎分離的大腸桿菌和健康奶牛糞便中分離的共生大腸桿菌進行基因組學分析，同樣也顯示，引起奶牛乳房炎大腸桿菌沒有特殊的致病因子。

3 奶牛乳房炎大腸桿菌的血清型研究

奶牛乳房炎大腸桿菌和其他動物源大腸桿菌一樣血清型非常復雜，O抗原有196種，K抗原有80種，H抗原有56種，基于O、H和K抗原已經識別超過700種血清型，但致病性大腸桿菌的血清型數量僅占少數。傳統的大腸桿菌血清型鑒定方法主要是用家兔制備的高免因子血清進行免疫擴散或乳膠凝集試驗，由于商品化的分型血清制備時間長達幾個月，價格昂貴，有些O抗原血清會遇到菌體發生自凝或粗糙型無法分型等情況，同時有些分型血清還因為效價低、血清交叉反應等影響，造成有些菌株鑒定錯誤或無法鑒定等問題[3]。因此，科研人員為了提高分型檢測的準確度，創建了基于基因wzx/wzy、wzm/wzt特異性DNA片段或rfb基因簇差異區域DNA序列設計特異性引物進行PCR血清分型鑒定的方法，大大提高了大腸桿菌的分型鑒定準確率。王娟芳等[17]建立了同時檢測致病性大腸桿菌O1、O2和O78血清型的三重PCR檢測方法，對146株大腸桿菌血清型進行檢測，結果特異性良好，準確率為99.32%。

楊彩霞等[18]對從遼寧地區16家奶牛場采集的151份臨床型乳房炎奶樣中分離鑒定出的84株大腸桿菌，進行血清型研究，結果59株為O抗原血清型，優勢血清型為O51、O60、O148、O21等10個血清型，25株未能鑒定出血清型。黃龍[19]對從寧夏地區采集的臨床型乳房炎奶樣中分離出的120株大腸桿菌，進行O抗原血清型鑒定，結果71株鑒定出21種血清型，優勢血清型是O158、O126、O101、O91等7種，還有49株未能鑒定出血清型。MAHMOUD等[20]對伊朗地區患臨床乳房炎乳樣中分離出的大腸桿菌進行血清型鑒定，優勢血清型為O55、O111、O124。

從以上研究結果可以看出，引起奶牛乳房炎的大腸桿菌血清型眾多，不同地區及不同奶牛場由于氣候及管理因素不一樣，大腸桿菌優勢血清型均不同，這為研制有效的奶牛乳房炎大腸桿菌疫苗造成了困難。由于大腸桿菌的致病性與血清型有關，因此，對奶牛乳房炎大腸桿菌進行血清型研究，是今后有效預防和治療大腸桿菌性奶牛乳房炎的重要措施。

4 奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性研究

由于抗生素不規范的濫用，奶牛乳房炎大腸桿菌的耐藥性呈現逐年增加趨勢，而且多重耐藥形勢嚴峻。大腸桿菌是2017年世界衛生組織(WHO)發布的全球重要耐藥細菌之一。TOMAZI等[21]對從巴西東南部20個奶牛場2 637頭患臨床乳房炎的奶牛采集的4 212份奶樣分離鑒定出的276株大腸桿菌，進行藥敏試驗，結果顯示，70%的大腸桿菌對紅霉素、青霉素、苯唑西林等常用抗生素耐藥。姚偉等[22]對從遼寧地區某奶牛場采集的75頭患臨床型乳腺炎的奶樣中分離鑒定出的44株大腸桿菌，進行藥敏試驗，結果顯示，超過85%的菌株對磺胺類藥物高度耐藥，30%的菌株對氯霉素類藥物耐藥。張金寶等[23]對從寧夏地區部分奶牛場患奶牛乳房炎的奶樣中分離鑒定出的197株大腸桿菌進行藥敏試驗，結果顯示，氨芐西林耐藥率最高達68.48%，其次是多西環素、四環素和鏈霉素耐藥率達39%，而且多重耐藥非常嚴重。由于不同地區引起奶牛乳房炎的大腸桿菌對同一藥物的耐藥性存在很大差異，這可能與不同奶牛場使用抗生素種類不同及治療規范程度不一有關。由于大腸桿菌是人畜共患病原菌，其表現出來的高度耐藥和多重耐藥性，嚴重影響食品衛生及公共衛生安全。因此，長期開展和監測奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性是有效預防和治療大腸桿菌性奶牛乳房炎，保障人類食品安全的一個重要措施。

5 奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥機制研究

大腸桿菌屬于革蘭陰性桿菌，由于其外膜結構的特殊性，導致其對許多抗生素具有天然耐藥性。除了天然耐藥性，細菌還能通過基因突變或基因的水平轉移獲得耐藥性。牛源大腸桿菌的耐藥機制，主要分為3類：降低膜的通透性和外排泵過量表達，使胞內抗生素達不到最小抑菌濃度；抗生素作用的靶位點改變；產生滅活酶或鈍化酶。

5.1 降低膜的通透性和外排泵過量表達大腸桿菌獨特的外膜結構使許多抗生素無法到達胞內，從而產生耐藥性。研究顯示，親水性抗生素可以通過大腸桿菌無特異性的外膜蛋白OmpF和OmpC進入胞內，但耐藥菌株通過減少外膜蛋白的表達量降低外膜的通透性或用特異性更好的通道替代孔蛋白，使進入胞內的抗生素減少，達不到最小抑菌濃度，從而對抗生素產生耐藥性[24-25]。同時還發現，在腸桿菌中，孔蛋白表達量的減少能對碳青霉烯類和頭孢菌素類同樣產生耐藥性[26]。

外排泵是大腸桿菌對許多抗生素耐藥的主要原因，當外排泵過量表達時，進入菌體內的抗生素被排出，使藥物濃度處于低水平，對常用抗生素產生高度耐藥性。新的多藥外排泵不斷被發現，如變異鏈球的MdeA，肺炎克伯雷桿菌的KexD和金黃色葡萄球菌的LmrS[27-28]。對大腸桿菌RND家族的AcrAB-TolC外排泵研究較多，是由三聚體內膜蛋白AcrB、周質融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC組成[29]。研究顯示，AcrB有遠端和近端2個結合位點，可以結合不同種類的抗生素，從而產生多藥耐藥性[30]。雖然大腸桿菌染色體上都攜帶有編碼多藥外排泵的基因，但仍在質粒上檢測到多藥外排泵的基因。

5.2 抗生素作用的靶位點改變通常抗生素與靶位點特異性結合才能發揮抑菌作用，若靶位點結構改變，會降低抗生素與靶位點的親和力，從而使細菌產生對抗生素的耐藥性。大腸桿菌可以通過單個基因位點突變或鑲嵌基因修飾靶蛋白，從而產生對抗生素的耐藥性。研究顯示，大腸桿菌編碼的DNA回旋酶(gyrA、gyrB和拓撲異構酶)的parC和parE基因發生突變，使DNA回旋酶和拓撲異構酶結構發生改變，導致喹諾酮類抗生素與菌體結合靶位點的親和力降低，從而使大腸桿菌對喹諾酮類藥物產生了耐藥[31]。此外，大腸桿菌還可以對靶蛋白進行保護性修飾，從而產生耐藥性。紅霉素核糖體甲基化酶(erm)和耐氯霉素-氟苯尼考(cfr)耐藥基因通過質粒廣泛傳播[32]。erm可使16S rRNA甲基化，從而使大腸桿菌對大環內酯類、林可酰胺類和鏈霉素類產生耐藥性[33]。cfr的甲基轉移酶能特異性地修飾23S rRNA的A2503，從而使大腸桿菌對氯霉素、鏈霉素類和惡唑烷酮類等抗生素產生廣泛的耐藥性[34]。另外，armA和rmt基因編碼的甲基轉移酶可使16S rRNA甲基化，使大腸桿菌對氨基糖苷類藥物產生高度耐藥。

5.3 產生滅活酶或鈍化酶大腸桿菌產生直接對抗生素進行水解或修飾的鈍化酶是對抗生素產生耐藥性的主要機制。有很多鈍化酶已經被發現，能對β-內酰胺類、氨基糖苷類、氯霉素類和大環內酯類抗生素進行水解或修飾。人們發現各種β-內酰胺類鈍化酶都能水解β-內酰胺類抗生素，形成交叉耐藥。有些鈍化酶的抗菌譜已經擴大，如早期的β-內酰胺酶只能水解第1代β-內酰胺類抗生素，現在ESBLs能水解氧化頭孢烯類抗生素[35]。從對β-內酰胺類抗生素耐藥菌中已經分離出各種ESBLs和碳青霉烯酶的耐藥基因，如在革蘭陰性大腸桿菌中發現的IMP、VIM、KPC、OXA和NDM鈍化酶。ESBLs的耐藥基因主要由CTX-M家族基因編碼，其中CTX-M14和CTX-M15酶檢出率最高[36]。由kpc和ndm基因編碼的碳青霉烯酶包括β-內酰胺酶A、B和D，能對碳青霉烯類和廣譜頭孢菌素類抗生素產生耐藥，這些耐藥基因通過染色體和質粒在細菌中廣泛傳播[37]。

對抗生素的化學基團進行修飾，阻礙抗生素與靶位點結合，從而對抗生素產生高度耐藥性。氨基糖苷類抗生素有許多羥基和氨基暴露出來，易被乙酰轉移酶、磷酸轉移酶和核酸轉移酶進行化學基團修飾。還有利福平磷酸轉移酶，它的耐藥基因在致病菌中廣泛存在[38]。

綜上所述，奶牛乳房炎大腸桿菌的耐藥機制錯綜復雜，通過質粒上耐藥基因轉移獲得耐藥性，是細菌耐藥性檢出率升高和產生多重耐藥的主要原因。因此，單純開發新藥永遠趕不上大腸桿菌產生耐藥性的速度。因此，探明奶牛乳房炎大腸桿菌的耐藥機制非常重要，未來研究消除大腸桿菌耐藥性的抑制劑及減少耐藥的方法，將為現有藥物的新用及協同用藥提供科學依據。

6 奶牛乳房炎大腸桿菌的防控策略

擠奶前后消毒對奶牛乳頭消毒措施的實施和干奶期治療，使傳染性乳房炎得到很好的控制。但這些措施治療大腸桿菌性乳房炎的效果不明顯，大腸桿菌的防控更依賴于減少環境中致病性大腸桿菌的數量、提高營養水平或接種疫苗提高機體的免疫力。

6.1 防控奶牛乳房炎大腸桿菌的疫苗研究由于奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性越來越嚴重的趨勢，研究大腸桿菌疫苗顯得極為重要。目前奶牛乳房炎大腸桿菌疫苗研究，最成功的是美國的J5疫苗，該疫苗選用的是1株擁有不完全O多糖的突變株，也就是突變株的脂多糖核心區和脂A區抗原是裸露的，這樣就使裸露的核心抗原可以刺激機體產生抗原，從而提高乳中和血清中抗大腸桿菌抗原的抗體效價。臨床使用結果顯示，奶牛肩胛部接種J5疫苗后，血清中IgG1和IgG2抗體水平顯著高于對照組，可減少因腸桿菌感染引起的乳房炎發病率，降低奶產量損失和淘汰率。此疫苗目前已經商業化，在全世界多個國家得到廣泛應用[39]。候書寶[40]構建可表達脂多糖蛋白的奶牛乳房炎大腸桿菌lps基因工程亞單位疫苗，小鼠免疫脂多糖蛋白疫苗后特異性抗體和免疫活性細胞因子表達水平與對照組比較明顯提高，可顯著提高血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平，免疫小鼠用野生強毒株大腸桿菌攻毒后，脂多糖蛋白疫苗組的保護率達60%～70%，明顯高于質粒免疫組(20%)和對照組(0%)。增強宿主對病原菌的免疫力是防控致奶牛乳房炎大腸桿菌的有效措施。有報道牛免疫大腸桿菌疫苗后可減少大腸桿菌O157在牛群和人群中的流行，還可以減少奶牛乳房炎發病造成的損失[41]。目前，致病性大腸桿菌疫苗在人、雞、豬有較多的研究。預防奶牛乳房炎大腸桿菌的商品化疫苗較少，大部分處于實驗室階段，借助基因組學和蛋白組學分析技術，有望加快疫苗研發速度和進程。

6.2 防控大腸桿菌性乳房炎的營養管理長久以來，營養管理在乳房炎發病中的作用很難跟其他影響因素區分開，所以一直存在爭議。直到有研究證明飼料中缺乏維生素E和硒會增加臨床乳房炎的發病率和感染時間，后續研究證明，硒在維持中性粒細胞功能具有重要作用，缺硒的牛群亞臨床和臨床乳房炎的發病率增加。乳房免疫系統的激活需要微量元素銅、鈷、錳和維生素A、C、E等，哺乳期奶牛應在日糧中添加這些微量元素來提高乳房免疫力，增加清除大腸桿菌的能力[42]。

6.3 防控奶牛乳房炎大腸桿菌管理措施經過幾十年的研究，人們認識到，防控乳房炎的基礎是防止健康奶牛發生感染，并縮短奶牛持續感染時間。嚴格擠奶措施的實施和抗生素的使用，使傳染性乳房炎得到了有效的控制，但這些措施對大腸桿菌無明顯效果。致奶牛乳房炎大腸桿菌的防控主要取決于減少乳頭接觸病原體，增加奶牛對感染的抵抗力。大腸桿菌屬于環境病原菌，其導致的乳房炎的主要原因是環境管理不當，如臥床潮濕、牛舍環境差和蚊蠅亂飛等，因此必須重視環境衛生的消毒，尤其運動場泥濘或梅雨季節更應重視綜合防控，減少環境中乳房炎病原菌的載量。有機墊料能為大腸桿菌和環境鏈球菌提供充足營養，細顆粒有機墊料更易黏附在乳頭表面，增加乳頭暴露病原體的風險，所以定期進行墊料的更換或使用無機墊料減少病原菌的滋生[42]。還有保持奶牛乳房衛生、在擠奶前后對擠奶工的雙手和擠奶機進行消毒、擠奶后對乳頭進行藥浴、干奶期使用長效抗生素進行乳房灌注治療和撲殺長期感染的奶牛等措施。每季度使用診斷試劑對牛群進行乳房炎篩查，根據實驗室藥敏試驗結果進行抗生素治療和綜合防控措施的改進，爭取做到早發現、早治療，防止向臨床乳房炎發展。

7 前景與展望

本研究團隊長期對我國奶牛場開展乳房炎病原菌區系分布及抗生素耐藥性監測研究，結果發現，大腸桿菌的檢出率與環境衛生和管理因素有非常大的關系，大腸桿菌產生耐藥性的原因與牛場長期使用一種抗生素及不規范濫用有關，因此，為了降低大腸桿菌性乳房炎發病率，提高治療效果，對奶牛場加強衛生管理及定期環境消毒顯得極為重要，其次在用藥方面進行治療前病原菌抗生素敏感性檢測，用藥要搭配使用，療程要足夠是取得良好治療效果的關鍵。目前，由于越來越嚴重的牛源大腸桿菌耐藥性的出現，使奶牛乳房炎的治療效果不斷下降，因此，加強大腸桿菌耐藥機制的研究刻不容緩。由于奶牛乳房炎大腸桿菌是人畜共患病原菌，其耐藥性可通過質粒基因轉移獲得，因此，長期開展和監測奶牛乳房炎大腸桿菌耐藥性是有效預防和治療大腸桿菌性奶牛乳房炎，保障人類健康及食品衛生的一個重要措施。研究消除大腸桿菌耐藥性的機制及降低耐藥性的抗生素增效劑，將為現有藥物的新用及協同用藥提供科學依據。由于牛源大腸桿菌血清型復雜，免疫機制多樣，給疫苗研究帶來困難。本研究團隊發現奶牛乳房炎滅活大腸桿菌疫苗免疫效果不佳的原因與疫苗菌株血清型與發病牛場大腸桿菌血清型不一致有關，其次是滅活苗只能誘導機體產生體液免疫，最終導致免疫效果不佳。未來新技術的使用對新型大腸桿菌疫苗的研制將起到推動性的作用，例如各類亞單位疫苗、載體疫苗和核酸疫苗的興起將帶來新的希望，它們不僅具有更高的免疫原性，更安全和穩定。未來，利用基因重組、基因缺失和反向編輯技術研制新型大腸桿菌疫苗效果會更加期待。