納米技術和納米材料在結核防治中的應用

劉一朵，梁正敏，趙德明，周向梅 (中國農業大學 動物醫學學院，北京 100193)

結核病是最致命的人畜共患病之一，他是全球十大死亡原因之一，也是世界范圍內的公共衛生問題。據世界衛生組織(WHO)統計，2018年，在全球范圍內估計有1 000萬人罹患結核病，而中國預估有86萬新發結核病病例，仍是結核病高負擔國家[1]。同時，全球因牛結核病造成的損失高達30億美元，在部分發展中國家，牛結核病威脅著人類健康[2]。由于卡介苗對于成人保護和不同地區保護力不同的局限性以及耐藥性結核不容樂觀的控制現狀，亟需開發新的策略來預防和控制人畜結核病。

納米技術是目前熱門的研究方向之一，基于其制備的納米制劑在生物醫學上具有廣泛的應用潛力。由于納米制劑的高反應活性和大比表面積，是良好的吸附劑、催化劑和傳感器。納米遞送系統是指將目的藥物或者抗原成分溶解，包裹于脂質體或高分聚合物等載體系統制成納米顆粒。基于納米顆粒的遞送系統具有優良的機體相容性和靶向性，易于通過生物屏障，可以提高藥物的生物利用度，在結核防治方面具有良好的發展前景。同樣，基于納米技術的檢測方法作為結核診斷手段也正在受到關注。本研究綜述了納米技術在結核病治療、預防和檢測方面的應用及優點。

1 納米系統在結核治療中的應用

針對敏感型結核的治療標準方案通常是一線藥物異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin,RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)聯合使用6個月，每種藥物都有毒副作用且長期用藥易產生耐藥性和病人依從性降低的問題。而耐藥菌株的出現使結核的治療更為復雜，根據WHO的數據[1]，2018年約有50萬利福平耐藥結核病病例(其中78%為耐多藥結核病)，如何控制結核耐藥性的產生成為世界性難題。納米系統在結核治療上的研究已取得了顯著進展,納米遞送系統可提高藥物的生物利用度、減少給藥劑量和頻率、增加可能的給藥途徑,增強藥物的穩定性,且成本低,是一種具有廣泛應用前景的新型抗結核方法。

1.1 脂質體脂質體是50～100 nm大小的球形微囊，通常具有脂質雙層外殼和水相內核。根據藥物性質，可以選擇將藥物包裹于脂質體的親水內核或脂質層，將其準確遞送至靶器官或者靶細胞。脂質體具有良好的生物可降解性和靶向性，易于透過生物膜，通過緩慢釋放藥物，從而減少了暴露于敏感組織或器官的藥量，減少毒副作用和耐藥性的產生，是靶向遞送藥物的理想載體。已有針對真菌感染的脂質體兩性霉素B和針對乳腺癌的脂質體阿霉素被批準上市[3],顯示出脂質體用于結核病治療的應用前景。

近年研究表明脂質體是良好的抗結核藥物遞送系統，包裹利福布汀的脂質體與傳統利福布汀給藥相比，在小鼠感染結核模型中減少了肺臟和脾臟的載菌量，肺部病理損傷也有所減輕，而其中用二棕櫚酰磷脂酰膽堿∶二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPC∶DPPG)制備的脂質體制劑最有效[4];MANCA等[5]發現脂質體的脂質成分對利福平向肺部遞送有影響，其中外殼磷脂成分更高的利福平脂質體表現出更優良的霧化性質以及被細胞攝取的能力，可以通過呼吸道有效遞送藥物；松蘿酸(UA)是一種已被證明對結核分枝桿菌有效的天然化合物，但效力不高，FERRAZ等[6]發現將松蘿酸包裹進脂質體增強了其抗結核分枝桿菌效力，最低抑菌質量濃度由31.25 mg/L降至0.98 mg/L，與利福平聯用也顯示出良好的協同作用(分數抑制濃度指數FICI=0.28)。

1.2 納米聚合物聚合物納米顆粒是天然高分子材料或合成的具有生物相容性和生物可降解性的固體納米膠體系統，可將藥物溶解、截留、包封或吸附在其上遞送至靶器官釋放。線性聚合物如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等和兩親性嵌段共聚物是2種主要類型的聚合物納米顆粒，被廣泛用于抗菌藥物的遞送。這些聚合物可以改變顆粒大小、長度和表面活性劑，從而適用于不同給藥方式。目前，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid，PLGA)及聚乳酸(polylactic acid,PLA)被認為是無害、無刺激的的綠色高分子聚合物，可在體內分解為乳酸[7],也是常用于開發納米制劑的高分子材料。

異煙肼作為親水性抗結核藥物在PLGA中的包載率較低，FARIA等[8]用檸檬酸處理異煙肼得到與其作用類似的異煙肼檸檬酸醛(JVA)，開發出JVA-PLGA納米顆粒，提高了藥物包封率。其研究表明JVA-PLGA可以增強巨噬細胞對分枝桿菌的殺傷作用，并促進藥物細胞內生物利用度，可以直接與分枝桿菌相互作用，有助于以低藥量殺滅肉芽腫中的細菌。為更有效的降低用藥量，分枝桿菌細胞壁成分分枝桿菌酸(MA)被用于納米顆粒表面作為靶向配體，LEMMER等[9]設計了一種包載異煙肼的新型納米制劑MA-INH-PLGA,發現加入MA之后感染鳥分枝桿菌或牛分枝桿菌的巨噬細胞攝取納米顆粒的能力顯著增加，這可能是因為MA作為分枝桿菌的毒力因子及其膽甾類性質可以與感染細胞表面受體結合，從而也大大提高了藥物進入細胞的速度及濃度。而在大鼠模型中，氣溶膠形式吸入的甘露醇修飾的利福平PLGA納米顆粒可長時間沉積于肺部并靶向巨噬細胞[10]。

1.3 納米乳納米乳或微乳是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑按適當的比例形成的粒徑為1～100 nm乳滴分散在另一種溶液中的熱力學穩定體系[11]。納米乳的類型與普通乳劑一樣分3種，水包油(O/W)型、油包水(W/O)型及雙連續型(W/O/W或O/W/O)，納米乳可以提高難溶性藥物的溶解度，發揮緩釋作用，與脂質體分散系相比有更高的穩定度。MEHTA等[12]制備了以吐溫80為表面活化劑的異煙肼微乳，是一種水包油型乳液，具有成本低、穩定性高、易于制備的優點，并能控制持續緩慢釋放異煙肼。PETER等[13]開發了氯法齊明納米乳，改善氯法齊明溶解性差和毒副作用的特點，并且在小鼠鳥分枝桿菌感染模型中，氯法齊明納米乳顯示出比脂質體載體更好的抗菌效力。

1.4 無機納米材料作為抗菌材料，納米顆?？梢酝ㄟ^遞送抗生素發揮協同作用，也可以根據特性單獨發揮作用。納米金屬或金屬氧化物材料可以作為一種易于制備的抗菌材料，減少耐藥性的產生。這類材料具有多種抗菌機制，如損傷細菌細胞膜、釋放有毒的金屬離子如Zn2+、Cd2+和Ag+，抑制細菌蛋白質及酶的合成等。

分枝桿菌需要吸收鐵元素來合成分枝桿菌素，針對這一特性可以開發新的抗結核方法。NARAYANASAMY等[14]制備了Ga納米顆粒，由于鎵(Ga)與鐵(Fe)的相似性，分枝桿菌錯誤地吸收了Ga3+從而阻斷了Fe3+的結合位點，通過這一機制，Ga納米顆粒成功抑制了HIV-TB合并感染巨噬細胞中病原體的生長。Ag納米材料已確認了2種抗菌機制，包括接觸殺傷和離子介導的殺傷[15]。此外，ZnO納米材料的抗菌機制是產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)，從而損傷細菌膜、DNA和蛋白質[16]。BANU等[17]評估了銀納米顆粒對耐藥結核分枝桿菌的抗菌效力，發現質量濃度為6.25～12.5 mg/L可以抑制結核分枝桿菌的生長。HEIDARY等[18]研究了Ag、ZnO和Ag-ZnO納米顆粒對耐藥結核分枝桿菌的效力，結果顯示，與單獨使用相比，Ag和ZnO納米顆粒聯合對結核分枝桿菌菌株的殺傷更大，并且對耐藥菌株的殺傷力大于對敏感菌株，表明Ag-ZnO納米顆粒能有效抵抗耐藥結核分枝桿菌。對于金屬顆粒的毒性，可以考慮在納米材料表面合成具有生物相容性的植物衍生的次生代謝產物涂層，以減少對人體健康的有害影響。

1.5 基于藻酸鹽的納米遞送系統海藻酸是一種天然多糖，也是一種優良的高分子材料，其相對分子質量為10～60 kDa，具有污染小、可再生、無毒性、儲量豐富等特點[19]。藻酸鹽通常與殼聚糖聯合使用在藥物遞送緩釋方面有著廣泛的應用。藻酸鹽中存在陰離子羧基組可與陽離子殼聚糖緊密吸附，形成穩定的微球結構。藻酸鹽作為水溶性聚合物在體內清除率比脂類載體高，但人體缺乏在分子水平降解高分子藻酸鹽的酶，所以藻酸鹽的相對分子質量應保持在50 kDa以下，以便腎臟能夠清除[20]。ZAHOOR等[21]制備了包裹異煙肼、利福平和吡嗪酰胺的霧化藻酸鹽納米顆粒，發現霧化15 d，所有器官(肺臟，肝臟和脾臟)中的所有藥物均高于最低抑制濃度，而游離藥物僅1 d。

2 納米系統在結核疫苗中的應用

2015年，歐洲藥品管理局(EMA)認為新型瘧疾疫苗Mosquirix可被用于非洲6周到17個月的兒童免疫接種，該疫苗含有納米級脂質體佐劑[22]，顯示出納米制劑在開發疫苗方面的遠大前景。針對結核分枝桿菌這類胞內寄生菌，對能夠調節機體Th1細胞依賴性免疫的疫苗有迫切需要，這對于機體獲得持久免疫力和有效保護力有著關鍵作用。與傳統疫苗相比，納米疫苗具有生物相容性、非免疫原性和靶向性的特點，并且可以長時間緩慢且持續地釋放抗原,一些納米顆粒具有易于被APC(antigen present cell)攝取的能力，在結核疫苗開發方面顯示出足夠的潛力。

近期，納米系統在結核疫苗方面的應用研究主要集中于包載或吸附結核抗原以及抗菌肽。HART等[23]利用納米級的巴西棕櫚蠟制備了包載有結核抗原Ag85B(早期表達)、Acr(后期表達)和HBHA(黏附素)融合蛋白的新型疫苗，在小鼠結核感染模型中能有效增強BCG的免疫效果，并誘導大量CD4+細胞和CD8+細胞增殖以及肺部組織駐留記憶T細胞的產生。MALIK等[24]開發了一種H1-PLGA結核疫苗，包載結核抗原Ag85B-ESAT6融合蛋白，單劑該疫苗接種6周后，與單獨Ag85B-ESAT6相比，H1-PLGA免疫的C57BL/6J小鼠血清抗體顯著增加，并且IFN-γ和TNF-α水平分別升高了約6.03和2.80倍，顯示出強烈的Th1細胞免疫反應。抗菌肽是各種動植物等生物體非特異性免疫中的重要組成成分，既可以在免疫反應過程中發揮正向作用，又能反向調節使機體免疫功能恢復正常,經常用于疫苗的免疫增強劑。SILVA等[25]將抗菌肽LLKKK18包在納米凝膠中，發現其能被巨噬細胞有效攝取，體內體外試驗均能有效降低結核分枝桿菌載量。

納米疫苗遞送系統具有同時將抗原和免疫增強劑遞送至相同樹突細胞或巨噬細胞的能力,聚合物納米粒子具有可調整的特性，是一種理想的載體，其中PLGA顆粒的表面經過一定的修飾能夠誘導黏膜免疫，增強免疫效果，并能夠彌補亞單位疫苗口服或鼻腔給藥的弊端。本課題組選用PLGA高分子材料包封結核分枝桿菌抗原argF蛋白[26]和CFP-10蛋白[27]，制備了2種防治牛分枝桿菌感染的亞單位納米微粒，在體外和體內試驗中驗證了這2種納米微粒在一定程度上能有效增強卡介苗誘導的抗結核免疫力，相關納米疫苗的研究也在進行中。

3 納米技術在結核診斷中的應用

為了控制結核的傳播，及時和準確的診斷手段至關重要。納米粒子的物理和化學性質允許進行準確、快速、靈敏和經濟高效的診斷，現已開發多種基于納米技術的檢測方法。

QIN等[28]建立了一種基于熒光納米粒子的間接免疫熒光顯微鏡技術(FNP-IIFM)，使用抗結核分枝桿菌抗體識別結核分枝桿菌的一抗，然后在標記的二氧化硅納米顆粒包裹抗體結合蛋白(蛋白質A)，隨之產生熒光信號進行顯微鏡檢查，與傳統方法相比有更強的信號和光穩定性，可以在4 h內檢測結核分枝桿菌復合物。DNA納米金探針技術是目前熱門的結核檢測研究方向，該方法靈敏度高，操作簡便，適合于發展中國家推廣。2017年，TSAI等[29]開發了一種納米金探針技術用于結核檢測，該方法基于與檢測樣品DNA雜交的單鏈DNA探針分子的作用，DNA雜交改變了納米顆粒的表面電荷密度發生不同程度的聚集，從而影響金納米顆粒的顏色變化，通過在紙質平臺顯色并比色,達到了1.95×10-2μg/L的檢測限。李海燕等[30]將納米金技術與基因芯片結合開發了一種DNA納米金探針新方法，通過納米金顆粒將檢測信號放大，并通過生物素化的信號探針顯色將基因芯片上的檢測信號轉化成肉眼可見的信號或通過普通儀器即可掃描的信號，從而確定樣本中細菌核酸的存在。

在動物結核檢測方面，CHEN等[31]開發了一種金納米顆粒修飾的納米生物傳感器用于快速檢測牛奶中的牛分枝桿菌，檢測限達到了3.5×103CFU/mL，該方法將殼聚糖、金納米顆粒(AuNPs)和堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠抗體(ALP-IgG)的混合溶液滴加到玻碳電極上形成具有良好性能的堅固膜即生物傳感器，通過抗分枝桿菌的抗體與ALP-IgG的反應，可鑒定是否有牛分枝桿菌被固定在膜上,納米技術在結核診斷方面也有巨大潛力。

4 建議與展望

納米顆粒具有3種特點[32]：尺寸微小，易通過生物屏障和組織間隙，在細胞水平釋放所載藥物；表面原子處于高能狀態，常具有催化活性;避免藥物和體液直接接觸，一來減少毒副作用，二來保存所載抗原的活性，有利于抗原的持續作用。近年來的研究表明，不同納米材料在結核防治中優缺點各異(表1)，在控制人畜結核方面有著巨大潛力。盡管如此，納米技術在結核上的應用也有一些難題，如納米顆粒的安全性問題和納米技術在潛伏性結核感染上的局限性。

表1 不同納米材料在結核防治中的優缺點

粒徑、電位、表面親疏水性等理化性質往往可以決定納米顆粒被細胞攝取和細胞作用的方式，對納米顆粒理化性質的深入研究有助于開發出更高效的納米遞送系統，增加包載藥物或抗原與細胞的接觸機會；開發對人體危害小或者無害的納米系統，可以選擇天然綠色化合物修飾載體材料，減少納米顆粒的毒性；根據結核感染和機體免疫的特性設計納米材料，PI 等[33]根據結核分枝桿菌能逃逸溶酶體吞噬并限制藥物進入宿主細胞這一特性設計了一種靶向巨噬細胞的異煙肼納米硒顆粒，該納米顆?？梢匝杆龠M入巨噬細胞釋放異煙肼，促進細菌與溶酶體融合并與異煙肼協同殺傷細菌。

相信隨著納米技術的發展和科學研究的不斷深入，會有更多的納米藥物、納米疫苗和納米診斷方法進入臨床，為人畜結核的防控提供更有效的藥物、疫苗和診斷方法。