黃酮類中藥抗細菌溶血素研究進展

賀尚文，侯思魯，李秋月，張 慧，徐媛媛，劉曉曄，董 虹* (.北京農學院 獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京02206;2.北京大學，北京 0087)

畜牧養殖業中常用作抗生素替代物的飼料添加劑主要包括益生菌、植物提取物、中草藥、天然多糖和天然抗菌肽等[1-2]。其中中草藥因其具有資源豐富、功能多樣、毒性低等特點，被廣泛應用于飼料添加劑[3]。根據中草藥添加劑的特點和應用效果大致可分為免疫增強劑如刺五加、菜豆;抗微生物劑連翹、蒲公英;激素樣作用劑甘草、肉桂，増食劑五味子和鼠尾草等[4-5]。黃酮類中藥是中藥有效成分的重要一類，具有抗氧化、免疫調節等功能，在畜牧業中也被用作飼料添加劑在豬、反芻動物及魚類生產中應用，具有開發前景[6-8]。目前,黃酮類中藥被發現具有良好的抗溶血素效果，尤其是對金黃色葡萄球菌α-溶血素、李斯特菌溶血素及豬鏈球菌溶血素具有較好的抑制效果，主要通過抑制溶血素基因編碼、基因轉錄或直接中和溶血素等途徑抑制其活性。本研究將近年來對細菌溶血素具有良好抑制效果的黃酮類中藥進行總結歸納，為研究抗細菌溶血素機制和開發新型黃酮類中藥飼料添加劑提供參考。

1 溶血素分類概述

溶血素概念是FUSSLE等[9]在1981年研究金黃色葡萄球菌α-毒素作用機制時提出的。早期溶血素多根據其抗原特性進行命名，而目前針對新發現的溶血素主要根據其特性以菌名加溶素后綴(-lysin)進行命名[10]。根據溶血素的作用機制等不同可將溶血素分為兩大類，即重復子毒素家族(repeats in toxin family，RTX)和膽固醇依賴細胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family，CDC)[11]，代表性溶血素的主要毒性作用見表1[12-20]。其中,重復子毒素家族主要為革蘭陰性菌產物，代表性成員為埃希大腸桿菌溶血素(HlyA)，家族中其他溶血素有30%～75%基因序列與HlyA相同[21]。此家族具有9個串聯氨基酸重復出現的特殊分子結構，且它們在發揮致病作用時離不開Ca2+的幫助，需9肽結合區與鈣離子結合后才能發揮其毒性[22]。膽固醇依賴細胞溶素，主要由革蘭陽性菌產生，常見家族成員見表1[15]。正如他們的家族名字一樣，此類溶血素在發揮致病作用時需要借助靶細胞膜上的膽固醇。首先與靶細胞表面的膽固醇受體結合并通過復合變構，最終插入細胞膜中形成寡聚β-桶狀跨膜孔道而達到致病作用[23]。除此之外還有個別溶血素未歸到以上兩大家族，如金黃色葡萄球菌α-溶血素(Hla)等。

表1 常見溶血素的毒性作用

2 黃酮類中藥抗溶血素的作用機制

黃酮類中藥主要為2個具有酚羥基的苯環通過中央三碳原子相互連接而成，具有C6-C3-C6結構的一系列化合物，多依據中央三碳鏈的氧化程度及是否成環和連接B環位置等結構特點將其進行分類[24]。黃酮類中藥分布廣泛，是多種經典方劑中中草藥的主要活性成分，目前研究表明黃酮類中藥具有抑菌消炎[25]、保護血管內皮細胞免受損傷[26]、調節免疫相關信號通路[27]等多種生物學活性。除此之外，黃酮類中藥對細菌溶血素亦具有很好的抑制效果，主要通過直接阻止溶血素的生成或中和溶血素兩方面來實現對其的抑制效果。

這些黃酮類中藥具有明確的化學結構及性質，較復方中藥而言化學成分單一且純度較高，可以更好更深入地研究其抑制溶血素的具體機制，并將功能細化到結構，為后續抗毒素中藥篩選提供方向指導。本研究將近幾年來對細菌溶血素具有抑制作用的黃酮類中藥進行分類匯總，發現主要為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類及查爾酮類，且主要對Hla、單增李斯特菌細胞溶素(LLO)及豬鏈球菌細胞溶素(SLY)具有較好的效果。

2.1 黃酮類黃酮類即以2-苯基色原酮為基本母核的一類化合物類，與黃酮醇類的區別在于基本母核的C3位上無羥基或其他含氧取代基。常見的有芹菜素、香葉木素、黃芩苷、木蝴蝶素A、黃芩素、白楊素及木犀草素等，這些黃酮類中藥都具有抑制溶血素效果(圖1)。這些化合物分子結構平面性較強、分子排列緊密、分子間引力較大，故而難溶于水，黃酮醇類及查爾酮類亦是如此。在酸堿性方面，黃酮類中藥的酸性強弱與酚羥基的數目和位置有關。其中R2及R6位置取代基為羥基時，受P-Π共軛效應影響，酸性強于一般酚羥基，當R4位置取代基為酚羥基時，由于與羰基形成分子內氫鍵故酸性弱于一般酚羥基[28]。

1.芹菜素,R1-H,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；2.香葉木素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-H,R6-OH；3.黃芩苷,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-CO(CHOH)4COOH；4.木蝴蝶素A,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OCH3,R6-OH；5.黃芩素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-OH,R6-OH；6.白楊素,R1-H,R2-H,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH；7.木犀草素,R1-OH,R2-OH,R3-H,R4-OH,R5-H,R6-OH

芹菜素是一種可以從多種中藥，如半枝蓮[29]、女貞子[30]、紫蘇[31]、馬齒莧[32]等中提取的常見的黃酮類中藥。對于芹菜素的研究前期主要集中在對癌癥的預防及治療方面，而近期研究發現芹菜素可以通過抑制hla和agrA基因的轉錄降低金黃色葡萄球菌Hla的分泌，來抑制溶血活性[33-34]。其中hla是Hla的編碼基因，由agrA二元調控系統正調節，兩者在調節毒力因子表達方面發揮關鍵作用[35]。隨后研究發現在抑制Hla分泌上，噬菌體裂解酶(Lys GH15)與芹菜素聯合應用的效果優于單獨應用芹菜素，它們兩者表現出微弱的協同作用[36]。這提示黃酮類中藥聯合療法的潛在價值。香葉木素也被證明通過相同的機制抑制Hla的分泌[37]。

除了可直接通過降低Hla的表達來抑制溶血活性外，一些黃酮類中藥雖不能影響Hla的產生但卻仍以劑量依賴的方式抑制其活性。主要原因是這些黃酮類中藥抑制了Hla七聚體的形成。研究發現黃芩苷通過與Hla“三角形區域”殘基Y148、P151和P153結合，抑制Hla七聚體的形成,繼而對其活性產生抑制作用，最終阻斷其對機體的損害作用[38]。黃芩苷與Hla結合的分子動力學模擬構象見圖2。除黃芩苷外，木蝴蝶素A也被發現可以通過抑制Hla七聚體的形成影響溶血活性。但其與Hla作用的結合位點與黃芩苷不同。木蝴蝶素A通過結合Hla的Thr11、Thr12、Ile14、Gly15和Lys46殘基，破壞關鍵的“環狀”結構進而阻止Hla七聚體的形成，抑制溶血活性[39]。木蝴蝶素A與Hla結合的分子動力學模擬構象見圖3A，最終結合位點的靜電勢見圖3B，其中藍色為正電荷區域，紅色為負電荷區域，白色為中性區域。此外以上4種黃酮類化合物均可保護人肺泡上皮(A549)細胞免受金黃色葡萄球菌在共培養系統中引起的損傷。

圖2 黃芩苷與α-溶血素結合的分子動力學模擬構象[38]

圖3 木蝴蝶素A與α-溶血素結合的分子動力學模擬構象[39]

在研究針對李斯特菌溶血素的黃酮類中藥時，發現黃芩素及白楊素不抑制LLO的合成，可直接中和單增李斯特菌培養物上清及純化的LLO從而介導成孔活性[40]。木犀草素不抑制LLO編碼基因(hly)的轉錄，但可特異性地抑制hly的翻譯，從而降低單增李斯特菌菌體內外LLO含量。

2.2 黃酮醇類黃酮醇類中藥對于Hla、LLO及SLY均有抑制作用。據報道，異鼠李素，一種從藥用植物如銀杏[41]、沙棘[42]等中提取分離得到的，同時也在很多植物的花、葉和果實中存在的黃酮醇類中藥，通過下調RNAⅢ表達，抑制hla轉錄來達到抑制Hla分泌的效果，同時局部異鼠李素處理可保護免受金黃色葡萄球菌對A549細胞介導的細胞損傷[43-44]。其中RNAⅢ基因是正向調控Hla的二元調控系統agr的效應因子[35]。研究發現漆黃素不影響LLO的合成分泌但可通過抑制LLO與膽固醇的結合，阻止LLO的寡聚化作用，而降低其成孔活性，從而減少單增李斯特菌介導的細胞毒性[45]。另外，在對SLY抑制作用的研究中發現，黃酮醇類中藥桑色素可抑制SLY的溶血活性，但桑色素本身并不影響SLY的表達，而是通過直接中和SLY起到的抑制作用，同時還可顯著緩解豬鏈球菌介導的宿主細胞(J774細胞)損傷[46]。黃酮醇類中藥異鼠李素、漆黃素和桑色素結構見圖4。

1.異鼠李素,R1-H,R2-OCH3,R3-OH,R4-OH,R5-OH；2.漆黃素,R1-H,R2-OH,R3-OH,R4-H,R5-OH；3.桑色素,R1-OH,R2-H,R3-OH,R4-OH,R5-OH

2.3 二氫黃酮類二氫黃酮類為中央三碳原子C2、C3位雙鍵被還原為單鍵的一類黃酮類中藥[24]。如柚皮素和橙皮素等(圖5)。這類化合物的分子結構為非平面，分子排列不緊密，分子間引力較小,有利于水分子進入故而水溶性相對較大[28]。柚皮素是一種可從化橘紅、枳實及各種柑橘類水果(如葡萄柚、柚子、橙等)的果皮果肉中得到的二氫黃酮類中藥[47]。研究發現，發現柚皮素對于金黃色葡萄球菌所致的小鼠肺炎具有較好的療效[48]，隨后張雨[49]在其研究中發現柚皮素可通過抑制hla的轉錄水平來降低Hla的表達量，從而抑制溶血活性保護機體。此外，柚皮素還可以抑制金黃色葡萄球菌其他外毒素如，SEA、SEB和TSST-1的表達，并且同樣對A549細胞具有保護作用。橙皮素也被發現具有抑制Hla的作用，其作用機制與上述黃酮醇類中藥異鼠李素相同[50]。

圖5 二氫黃酮類中藥結構

2.4 查爾酮類查爾酮類的主要結構特點是C環未成環。其中被大家熟知的如：根皮素和甘草查爾酮E等，結構見圖6。研究發現，根皮素與甘草查爾酮E都以與黃酮類中藥芹菜素相同的機制抑制金黃色葡萄球菌Hla，其中根皮素還可保護A549細胞免受金葡菌的損傷[51-52]。除此之外，在根皮素的研究中還發現其可抑制單核細胞增生李斯特菌中的LLO表達，在研究其機制時發現根皮素處理并沒有影響hly轉錄，猜測可能是由于抑制了細胞質中LLO翻譯導致[53]，黃酮類中藥對溶血素的抑制機制總結見表2。

圖6 查爾酮類中藥結構

表2 黃酮類中藥對溶血素的抑制機制

3 討論

細菌溶血素是細菌致病的重要毒力因子，以溶血素為靶標，通過中和或抑制其分泌，降低細菌的致病性，隨后調動天然免疫細胞將細菌清除，可在保護機體的同時阻止細菌耐藥性的產生。以溶血素為目標進行干預，從而達到抗菌目的是當今研究的熱點，也是篩選抗菌藥物的一條新方向。

而目前在抑制細菌溶血素的研究中，越來越多的中藥被研究，并發現具有較好的抑制效果。但中藥成分的復雜性是研究的一大難題，而中藥單體較中藥而言具有明確的化學結構及理化性質，從而更利于研究。本研究總結各種結構的黃酮類中藥在抑制溶血素方面所發揮的作用，看到這類中藥在治療細菌性疾病中的巨大潛力。我國中藥資源豐富，黃酮類中藥分布廣泛，以黃酮類結構為導向篩選抗毒素藥物，對于研發新型抗菌藥、開發中藥飼料添加劑具有重大意義。同時在中藥復方的研究中，針對具有抗菌效果的中藥復方，如白頭翁湯等，或許可通過增加富含對溶血素有抑制效果的黃酮類成分的中藥，以優化中藥復方在治療細菌感染方面的作用。此外這些黃酮類中藥或許在一些由毒素引起的細菌混合感染中具有潛在作用。由此，在目前研究基礎上繼續開發利用黃酮類中藥具有巨大前景。