金黃色葡萄球菌生物膜形成及調控機制研究進展

李新圃，羅金印，武小虎，李宏勝，丁學智 (中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農業農村部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省中獸藥工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730050)

金黃色葡菌球菌(金葡菌)是一種生存能力極強且分布十分廣泛的條件性致病菌，既可作為一種無害的共生物存在于環境中以及人和動物的皮膚黏膜表面，又可引起許多感染性疾病，小到輕度淺表感染大到嚴重危害生命的重癥感染。在病理條件下，金葡菌能夠釋放多種致病性毒素，例如腸毒素A、α-溶血素、凝集因子A、纖維蛋白結合蛋白A、殺白細胞素、中毒休克毒素、血漿凝固酶、剝脫毒素A和耐熱核酸酶等，并且能夠針對治療的抗生素啟動相應的耐藥機制，歸納起來主要包括[1]：①促進藥物外排；②使酶制劑改性和失活；③藥物的結合位點被酶修飾；④產生干擾物質與藥物爭奪結合位點；⑤通過一些旁路機制獲得耐藥性；⑥通過基因突變改變藥物作用位點和細胞壁/膜的藥物滲透性等。

能夠促使金葡菌釋放毒素并啟動耐藥機制的病理條件，除了宿主本身免疫力下降和組織器官受損外，一個十分重要的因素就是金葡菌極易形成生物膜。生物膜是細菌通過自身分泌的胞外基質(ECM)相互黏連形成膜狀細菌群體，具有極強的黏附性、環境適應能力和自身保護作用[2]。自然環境中大多數細菌都能以生物膜的形式存在，生物膜能夠黏附在宿主的組織表面，一旦組織細胞受損，致病菌能夠不斷釋放毒素引發感染，并且可能進入機體內隨血液流動播散，導致全身性感染。在所有微生物和慢性感染中，分別有65%和80%與生物膜形成有關[3]。金葡菌生物膜還能夠抵御宿主免疫系統，更容易產生耐藥菌株，甚至多重耐藥菌株，這些耐藥菌株是導致慢性感染的主要病原，給人類和家畜的健康及生命造成極大的危害[4]。

1 金葡菌生物膜的形成機制

1.1 金葡菌生物膜細菌可以通過最初的黏附聚集，最終形成具有一定功能和結構的成熟生物膜，其功能結構十分復雜。研究發現，細菌生物膜是被自身產生的ECM包裹的細菌多細胞團體[2]。細菌可通過ECM自我屏蔽保護，免受逆境壓力。一些不利條件，例如營養限制或饑餓、化學物質和物理作用的攻擊等，均可觸發生物膜的形成。金葡菌ECM的主要成分是胞外多糖、蛋白質、磷壁酸和胞外DNA(eDNA)，并且每種成分的組成和比例都會因菌株不同而存在差異[5]。目前金葡菌生物膜的研究仍以體外模型為主，其形成機制主要存在兩種理論：一是基于最初的研究，認為金葡菌生物膜的形成與多糖胞間黏附素(PIA)有直接的關系，但進一步的研究發現，沒有PIA的金葡菌也能形成生物膜，因此根據生物膜初始黏附階段是否存在PIA，將生物膜形成分為PIA依賴和PIA非依賴途徑，即ica依賴和ica非依賴途徑[6]。二是隨著研究的深入，發現生物膜的形成過程可以分為4個階段，即初始附著、細胞聚集形成多細胞層、生物膜成熟并分離出單個浮游菌、膜表面的浮游菌分散并開啟新的生物膜周期[7]。這兩種理論相輔相成，從不同的側重點研究和闡明金葡菌生物膜的形成機制。

1.2 基于PIA的生物膜形成機制

1.2.1PIA依賴途徑 金葡菌生物膜形成過程的附著積累階段主要依賴于PIA，其合成主要受基因ica調控[8]。ica包括4個功能基因icaA、icaD、icaB和icaC和一個調節基因icaR。icaADBC編碼的葡糖胺轉移酶誘導產生胞外多糖，主要成份是PIA，它是β-(1，6)-N-乙酰葡糖胺多聚體(PNAG)，所以也被稱為PNAG，是生物膜基質中的主要多糖組分，是細胞成簇的主要功能性物質，能夠促進細菌之間的黏附聚集和細菌黏附到生物材料表面[9]。icaR是一個阻遏基因，敲除icaR或抑制icaR轉錄，icaABCD表達上調，PIA合成量增加，生物膜形成能力增強。PIA作為ECM的多糖成分在早期金葡菌生物膜形成過程中發揮重要作用，然而金葡菌icaA突變體缺乏PIA也能表現出正常的細胞積累作用，并且一些具有ica基因和PIA的菌株反而不能形成生物膜，說明金葡菌生物膜的形成并不完全依賴于PIA，還存在PIA非依賴形成途徑。

1.2.2PIA非依賴途徑 有些金葡菌菌株以不依賴PIA的方式黏附積累，如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)主要通過蛋白質而不是多糖形成生物膜[10]。金葡菌表面肽聚糖上共價錨定著一組以N端含有信號肽序列、C端含有“LPXTG”模體為特征的表面蛋白即細胞壁錨定(CWA)蛋白[11]，其中有一類能和ECM成分結合的蛋白分子，被稱為識別黏附基質分子的微生物表面成分(MSCRAMM)，它們被認為可以促使金葡菌牢固定植到特定的組織細胞表面以及附著在有血漿蛋白和胞外基質蛋白的非生物材料表面，參與細菌黏附聚集形成生物膜[12]。MSCRAMM家族主要包括凝集因子A(ClfA)和B(ClfB)，它們是介導金葡菌黏附到纖維蛋白原的表面黏附素[13]；纖維蛋白結合蛋白(FnBPs)是一類可以促進金葡菌與纖維蛋白原、彈性蛋白和纖連蛋白結合的多功能蛋白，其中的FnBPA和FnBPB主要參與菌體與生物表面的初始附著以及相鄰細胞間的黏附，介導生物膜的形成[14]；絲氨酸-天冬氨酸重復序列蛋白(Sdr)，其中的SdrC、SdrD和SdrG可以促進與純化的鱗狀細胞黏附[15]；骨唾液酸結合蛋白(Bbp)，能夠與纖維蛋白原結合，促進與胞外基質的黏附[9]；膠原黏附素(Can)，具有識別膠原蛋白三螺旋結構的作用，可以黏附到富含膠原蛋白的組織細胞上[16]。

最初使用MSCRAMM術語是認為金葡菌主要附著在細胞表面的糖結合物上[17]，但進一步的研究發現，一些能夠促使金葡菌定植黏附的CWA蛋白并不都是MSCRAMM家族成員，并且有些MSCRAMM蛋白除了能夠促進細胞間黏附外還有其他功能。因此，有人根據結構和功能將CWA蛋白分為4大類[15]，最大一類是MSCRAMMs蛋白，其特征具有DLL(dock， lock and latch)配體結合機制[18]，主要功能是參與細菌黏附和聚集，促進生物膜形成。其他介導生物膜形成的CWA蛋白還有鐵離子調控表面蛋白(Isd)、蛋白A和金葡菌表面蛋白G(SasG)。Isd包括IsdA、IsdB和IsdH，它們的配體結合機制均與NEAT(near iron transporter)基序有關[19]，能夠選擇性識別血紅素、纖維蛋白原、纖連蛋白、K10、葉黃素和β3整合素，促進細菌與生物細胞及其胞外基質的黏附；蛋白A在金葡菌中普遍存在，是一種多功能蛋白，具有重復三螺旋束結構，可以結合多個不同的配體，在生物膜形成過程發揮作用[20]；SasG與積累相關蛋白(Aap)密切相關，Aap是表皮葡萄球菌生物膜形成所必需的蛋白，它們均有G5-E結構(G5結構域被E區的50殘基序列隔開)[21]。另外，在MRSA中發現的纖溶酶敏感表面蛋白(Pls)是SasG同源物，可能與SasG有相似的功能機制，可黏附上皮細胞促進生物膜形成[22]。還有一類CWA蛋白在生物膜形成過程發揮重要作用，但它們的作用機制不是很清楚，例如生物膜相關蛋白(Bap)，能夠增進金葡萄在上皮細胞表面聚集促進生物膜形成，還有金葡菌表面蛋白X(SasX)和C(SasC)，在生物膜形成過程中促進金葡萄黏附和聚集[23]。

1.3 基于階段性發展的形成機制

1.3.1初始附著 金葡菌與非生物表面之間存在非特異性附著[24]。金葡菌可通過靜電和疏水作用附著在非生物表面上，ECM的成分磷壁酸帶有負電荷，能夠附著在聚苯乙烯和玻璃表面。自溶素(AtlA)有助于細胞在聚苯乙烯表面附著，atlA基因突變體在非生物表面形成生物膜的能力降低。金葡菌與生物表面之間還存在特異性附著。為了在生物體表面形成生物膜，浮游菌首先利用各種針對不同基質底物的CWA蛋白附著在生物體表面，這些CWA蛋白對宿主基質成分如纖維蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白、細胞角蛋白等具有不同的結合特異性，前面已進行了簡要介紹(詳見1.2.2)，這里不再累述。

1.3.2細胞聚集 初始附著后，為了維持尚未成熟的生物膜穩定，金葡菌會產生有助于穩定細胞間聚集的多種因子。研究顯示，細胞質蛋白烯醇酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)能夠響應生物膜環境的pH值降低，與eDNA結合附著在細胞表面，成為金葡菌生物膜的基質成分[25]。盡管尚不清楚這兩個缺乏信號肽的細胞質蛋白到達細胞外環境的轉運機制，但有人分析認為，隨著生物膜發育進入增殖階段，一些死亡細胞裂解并釋放DNA、細胞質蛋白烯醇酶和GAPDH等到細胞外環境成為ECM成分，并且相互作用促進細胞聚集，為生物膜的成熟奠定基礎[12]。此外，通常作用于染色體構造的胞質核苷關聯蛋白(NAPs)也可通過結合eDNA充當ECM組分蛋白，促進生物膜形成[26]。eDNA是一種潛在的靜電聚合物，可以促進細菌之間相互黏附和附著在生物體上，甚至黏附到非生物體上[27]。

1.3.3生物膜成熟 DNA和蛋白質在生物膜成熟過程中發揮重要的作用。eDNA是重要的生物膜基質成分，大多來自菌體自溶釋放的DNA，其過程受細胞壁水解酶介導和操縱子(cidABC/lrgAB)調控。cidABC/lrgAB具有類似穿孔素/抗穿孔素(holin/antiholin)的作用，cidA發揮holin的功能，可以在細胞膜形成孔道轉運細胞壁水解酶，而lrgA發揮antiholin的作用，抑制cidA作用調控eDNA產生[28]。同時eDNA被自身分泌的核酸酶(Nuc)降解使生物膜的總生物量減少[29]。eDNA起源于細胞裂解，并通過質粒插入其他菌的轉座子或致病島，有助于交換遺傳物質，使毒力因子和抗生素耐藥因子基因被交流[1]。使用Nuc降解eDNA，生物膜總量明顯減少，細菌對殺菌物質的敏感性顯著增加[28]。Nuc介導eDNA降解促進生物膜解離，可能是生物膜發育過程一個重要的調控階段，以便結構重建，形成更有利于生物膜發展的結構形態。

研究顯示，金葡菌生物膜在成熟過程中，不斷有細菌掙脫黏附，并殘留在基底層的細胞上形成微菌落結構，這一過程受操縱子cidABC和lrgAB的調控，這些微菌落的生長和分散速率均不完全相同[30]。由于微菌落的不斷解離和形成，生物膜結構不斷得到修飾和重塑，其中酚溶性調控蛋白(PSMs)發揮重要的介導作用。PSMs是一類具有α-螺旋結構的多肽兩性分子，具有表面活性劑的特點，可以破壞生物膜基質中大分子間的靜電和疏水作用，介導生物膜的分散[31]。PSMs主要在生物膜形成過程產生解離作用，若將PSMs加入到成熟的生物膜中，不能破壞成熟生物膜基質中多糖等大分子間的共價鍵[32]。當psm基因突變不能正常表達時，金葡菌生物膜內部微孔道減少、結構變厚，表面變得光滑[33]。

1.3.4生物膜的分散 成熟的生物膜外觀呈現蘑菇狀，內部的細菌不斷被解離和重新聚集，結構不斷修飾完善，當細菌密度達到一定的功能閾值時，就會觸發信號傳導系統，使生物膜進入分散階段，生物膜外表面的細菌脫離生物膜成為浮游菌，四處散播、附著，開啟新的生物膜周期，周而復始，造成病原菌不斷傳播，感染反復發作難以治愈[7]。金葡菌生物膜的分散在很大程度上受附屬基因調節子(Agr)調控[33]。Agr系統可調控相關細胞外蛋白酶的分泌，這些蛋白酶包括金屬蛋白酶(Aur)、半胱氨酸蛋白酶(ScpA、SspB)、絲氨酸蛋白酶(SspA或V8)和絲氨酸類蛋白酶(SplA、SplB、SplC、SplD、SplE、SplF)，它們與生物膜的解離密切相關，敲除這些蛋白酶基因或加入蛋白酶抑制劑能夠明顯抑制生物膜的解離[34]。當Agr低表達時，菌體表面的黏附因子不能被有效抑制，金葡菌生物膜形成能力增強，而當Agr高表達時，金葡菌生物膜形成能力降低，同時細胞外毒素分泌增多[35]。

Agr調控的生物膜分散機制涉及到PSMs的產生和作用。AgrA可以結合到細菌DNA的相應位點，降低表面蛋白的基因表達水平，促進psmα和psmβ轉錄，有助于生物膜分散[36]。而且PSMs只能在生物膜形成過程產生解離作用起到重塑結構的作用，不能破壞已成熟生物膜基質中的多糖等大分子間的共價鍵分散生物膜[32]，可能PSMs的作用主要是“形成狀態”影響了生物膜的完整性。雖然大多數研究顯示PSMs的類表面活性劑作用促進了生物膜的分散，但也有相反的研究結果，PSMs能夠聚集成不溶性淀粉樣纖維有助于維持生物膜結構，阻止生物膜擴散[37]，并且eDNA的存在促進了這些淀粉樣結構的形成[5]。這些看似矛盾的研究結果恰好說明生物膜不僅具有復雜的組成結構，而且存在復雜的調控系統，ECM成分之間通過相互協同和制約不斷促進生物膜的發展。分散是生物膜發展過程必不可少的作用模式，一方面有利于生物膜內的部微菌落重建，在基因表達、ECM組成和代謝水平上多樣化發展，能夠更好地抵御環境中的抗菌因子。另一方面有助于生物膜外部細菌脫離生物膜成為浮游狀態，恢復對抗菌藥物的敏感性，同時重新感染宿主、傳播病原和釋放毒素。

2 金葡菌生物膜的調控系統

2.1 QS系統細菌生物膜的形成有復雜的網絡調控系統調控，目前研究較多的主要是QS系統。QS是監測菌群數量和密度并感應周圍環境的重要機制，當信號分子濃度達到閾值，細菌可通過改變相關基因的表達，調控自身行為適應環境變化[36]。在QS調控下，細菌能夠分泌特定的信號分子并感應它的濃度變化，調控一些生物學功能，例如生物膜的形成和毒力因子的分泌等[38]。QS系統由一系列調控因子組成，葡萄球菌主要涉及到的調控因子有Agr、BigB、SarA、LuxS/AI-2蛋白和基因。

2.2 AgrAgr是金葡菌QS系統中最有代表性的調控因子，主要調控生物膜的解離和分散。Agr系統由AgrA、AgrB、AgrC和AgrD蛋白組成，由啟動子P2和P3啟動轉錄[39]。AgrD編碼自誘導肽(AIP)，AgrB有助于AIP的成熟和輸出，當細胞外AIP濃度達到閾值時，AgrC結合AIP使AgrA磷酸化，激活P2和P3。P2啟動RNAⅡ轉錄，編碼AgrA、AgrB、AgrC和AgrD。P3啟動轉錄效應分子RNAⅢ轉錄，通過不同途徑調控生物膜相關基因和一些毒力因子的表達。AgrA能夠增強PSM表達，促進生物膜分散[36]。Agr還能夠調控蛋白酶表達，降低金葡菌對細胞表面的黏附能力，促進生物膜的解離和分散[34]。當agr基因缺失時，金葡菌生物膜變厚、微孔道減少、表面更為光滑、失去解離播散能力，形成廣泛而密實的生物膜，更傾向于形成局部慢性感染[40]。

2.3 SarSarA蛋白與金葡菌生物膜的形成密切相關，在一定條件下促進Agr和RNAⅢ的表達，調節一些毒力基因的表達，對生物膜的形成和毒素的產生有重要的調節作用[41]。研究顯示，SarA可以特異性結合bap基因，啟動其表達，活化Bap蛋白，促進生物膜的形成；抑制核酸酶和蛋白酶的活性，減少eDNA及蛋白質的降解，有利于細菌黏附和聚集；促進ica轉錄參與金葡菌PIA的合成與調節，有助于PIA依賴生物膜的形成[42]。也有研究發現，SarA在金葡菌對數生長期上調CWA表達，抑制胞外蛋白酶的產生，促進細菌黏附和早期生物膜形成，而在對數生長后期結合到自身啟動子，促進生物膜的解離和播散，說明在金葡菌生物膜發展的不同階段，SarA通過發揮不同的作用，正向調控生物膜的形成[43]。因此，下調和敲除sarA均能降低金葡菌生物膜的形成能力[44]，同時提高對抗生素的敏感性。

2.4 轉錄因子SigBSigB(Sigma B)也被稱為σB，是調控金葡菌生物膜形成及毒素因子表達的重要因素，其功能比較復雜。研究發現，SigB可以通過調控agr和sar基因影響金葡菌生物膜的形成[45]；能夠降低核酸酶和蛋白酶的活性，促進eDNA釋放，增強生物膜的形成能力[46]；還能夠促進icaADBC轉錄水平增強，有助于PIA依賴金葡菌生物膜的發育，其突變株由于缺失sigB基因限制了生物膜的形成[42]。但也有不同的研究結果，在SigB存在下，Ica蛋白的轉換加速，PIA的合成減少，生物膜形成能力降低，而SigB突變體能夠積累更高水平的IcaC蛋白，比野生菌株產生更高水平的PIA，使生物膜形成能力增強[47]。這些看似矛盾的研究結果可能與金葡菌生物膜基質的差異性和多變性有關[5]，同時也反映了SigB在金葡菌生物膜形成過程具有多重作用和功能。

2.5 信號傳導系統(LuxS/AI-2)該系統是革蘭陽性和陰性細菌可共享的一個QS系統，可以介導非同種細菌之間的信號傳導[48]。在大多數革蘭陽性和陰性菌中都發現了自誘導物(AI-2)，其介導細菌間的信號交流，在細菌生物膜協同生長中起關鍵性作用[49]。AI-2衍生自4，5-二羥基-2，3-戊二酮(DPD)，DPD由酶(LuxS)活化甲基環而合成。AI-2是能夠相互轉化的化學構體結構，而不是單一的化合物。LuxS/AI-2系統通過上調IcaR，抑制icaA的轉錄，降低PIA依賴性生物膜的形成能力。敲除luxS基因可使IcaR下調，添加外源性AI-2可恢復其表達。因此，LuxS/AI-2可能對PIA依賴性生物膜的形成起負調控作用。

3 小結與展望

對生物膜組成結構的研究發現，由于金葡菌生物膜形成大量的ECM，能夠產生物理屏障，影響抗生素的擴散和分布，降低其殺菌作用，同時生物膜內部的細菌處于休眠狀態，生長代謝緩慢，影響各類抗生素在細菌不同生長階段發揮作用。生物膜形成機制相關研究發現，金葡菌生物膜不僅是細菌與ECM之間的黏附和堆砌，而且具有一定的功能性、結構性和調控性，能夠有序完成生物膜的黏附、聚集、成熟和播散，周而復始，導致菌體在感染部位難以被徹底清除，從而造成感染難以治愈，病原不斷擴散。對生物膜調控系統的研究發現，金葡菌生物膜涉及的調控因子，不僅參與生物膜的形成和調控，而且還參與其他毒素的釋放和調控，與金葡菌強大的耐藥性和致病性密切相關。相比浮游狀態，生物膜中的金葡菌對大多數抗菌素的敏感性降低，而耐藥性可提高10～1 000倍[50]。

金葡菌的耐藥問題不僅表現在臨床治療中，并且對新藥的開發研究也造成極大的影響。盡管目前抗菌藥物的研發已經取得很大的成效，但研發一個新藥仍需花費巨大的人力、物力、財力和時間。大多數抗生素只要應用到臨床上，就會產生耐藥菌株，尤其是金葡菌，很容易產生耐藥菌株，甚至多重耐藥菌株，不僅增加了新藥研發的成本，而且增大了研發的難度。因此，想要有效對抗金葡菌等引發的各種感染，就必須通過多種途徑，降低病原菌的耐藥性，充分發揮抗菌藥物的抗菌療效，例如群體感應抑制劑(QSI)的研究就是目前倍受關注的研發熱點。QSI是指對QS系統及其調控因子具有靶向干預作用的化合物，具有不易產生耐藥菌株的治療優勢。因此，有必要及時了解金葡菌生物膜形成機制方面的研究進展，更好地確立研究的目標和方向。