蚯蚓磨漿發酵產物減輕蘋果連作障礙的機制

潘鳳兵，姜偉濤，陳 冉，徐明娜，陳學森，沈 向，尹承苗，毛志泉*

（1 山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018；2 龍口市農業技術推廣中心，山東煙臺 265701）

蘋果連作障礙又叫蘋果再植病 (apple replant disease，ARD)，指在曾栽種過蘋果樹的老果園里再次種植蘋果幼樹時出現新樹長勢弱甚至死亡的現象，典型的蘋果連作障礙表現為植株矮小、生長衰弱且成活率低，果實產量降低、品質變劣[1-3]。受土地資源限制，蘋果連作障礙的發生已經成為我國蘋果主產區一個普遍存在、亟需解決的生產問題，嚴重制約了我國蘋果產業的可持續發展[4]。

蘋果連作障礙的成因復雜，主要可分為非生物因素和生物因素兩部分[5-6]。大量研究表明，生物因素是引起蘋果連作障礙的主要原因[7-9]，其中連作土壤中的各種真菌和卵菌被認為是引起蘋果連作障礙的關鍵因子[10-11]，同時以酚酸類物質為主的化感自毒物質是引起連作障礙的重要因素[3, 12]。同時大量研究表明，蚯蚓體液中含有的小分子肽具有廣譜的抗微生物活性[13-15]。張希春等[16]通過硫酸銨沉淀、超濾和陽離子交換分離，從蚯蚓勻漿液中得到的2種新的抗菌肽具有高效廣譜抗菌活性。Wolfarth等[17]的研究發現，利用流蚓屬蚯蚓覆蓋處理秸稈殘渣，可顯著降低鐮刀菌屬 (Fusarium) 真菌的數量。Plav?in 等[18]的研究發現蚯蚓體液提取物對農業生產中重要的植物病原真菌尖孢鐮刀菌的生長有抑制作用，且兩種不同種類蚯蚓的提取物均能抑制尖孢鐮刀菌的生長，72 h后這種抑制作用更加明顯。研究表明，通過微生物發酵動植物等蛋白底物可產生具有抗菌活性的生物活性肽，其具有廣譜抗菌活性，可以有效對抗農業中的植物細菌真菌感染[19-21]。近年來，抗菌肽已先后應用于醫藥、食品和農業等方面[22-23]，但關于抗菌肽對土壤有害微生物和果樹連作障礙的影響研究尚未見報道。

本試驗以蘋果樹栽培中的常用砧木[24]平邑甜茶為試材，探究連作條件下施入蚯蚓磨漿發酵產物對連作土壤微生物環境、土壤酚酸類物質和平邑甜茶幼苗生物量、根系構型、根系抗氧化酶活性和葉片葉綠素含量及光合指標的影響。探究蚯蚓磨漿發酵產物對蘋果連作障礙的防控效果，并初步探明其作用機理，以期為有效防治蘋果連作障礙提供技術支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的老蘋果園連作土壤取自山東省泰安市滿莊鎮27年生的紅富士老果園，砧木為八棱海棠(MalusrobustaRehd.)。土壤類型為棕壤，速效磷含量為 15.85 mg/kg、速效鉀含量為 152.05 mg/kg、銨態氮含量為13.09 mg/kg、硝態氮含量為7.68 mg/kg、土壤pH為6.2、有機質含量為9.35 g/kg。

供試材料為平邑甜茶 (MalushupeheusisRehd.) 實生苗。供試蚯蚓為大平1號蚯蚓 (Eiseniafoetida)，發酵菌種為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis) 和黑曲霉菌 (Aspergillusniger)。

試驗用盆為上部內徑25 cm、底部內徑17 cm、高18 cm的陶制花盆。

1.2 試驗設計

試驗于2018年在山東農業大學國家蘋果工程技術研究中心試驗基地進行。試驗設置5個處理：連作土對照 (CK)、連作土滅菌 (T1)、蚯蚓磨漿發酵產物 (T2)、蚯蚓磨漿發酵產物滅菌 (T3)、蚯蚓勻漿(T4)。連作土滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌法 (120℃，30 min)，蚯蚓磨漿發酵產物采用巴氏消毒法。

蚯蚓磨漿發酵產物制備方法為：將新鮮蚯蚓與水 (質量比4∶1) 在組織勻漿儀中進行勻漿制得組織勻漿液，組織勻漿液經巴氏消毒后接入發酵菌，發酵菌與組織勻漿液的加入比例是1∶1000，枯草芽孢桿菌的有效活菌數為 1×109CFU/mL，黑曲霉菌的孢子濃度為 1.2×109CFU/mL，將接種后的組織勻漿液置于37℃條件下有氧發酵 (PTFE無菌封口膜將發酵瓶封口，每日早中晚3次搖勻發酵瓶增加發酵液中溶解氧含量) 10 天。

按試驗設計處理連作土壤并裝盆，每個處理20盆，每盆6.5 kg供試土壤。蚯蚓磨漿發酵產物、滅菌發酵產物和蚯蚓勻漿的施用量一致，每盆32.5 mL。于4月底選取3棵長勢一致的平邑甜茶實生苗移栽到裝有不同處理供試土壤的花盆中，待緩苗結束后間苗保留2棵長勢一致的植株。平邑甜茶幼苗移栽后，所有處理均采用統一肥水管理，分別于8月底取樣測定土壤微生物環境、平邑甜茶幼苗生物量、根系相關指標以及葉片葉綠素含量、葉片光合參數等指標。

1.3 測定指標

土壤微生物總量的測定：采用常用的稀釋平板計數法測定。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基37℃條件下培養，真菌采用PDA選擇性培養基28℃條件下培養，放線菌采用改良高氏培養基28℃條件下培養[25]。

實時熒光定量 (real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)：參照尹承苗等[26]的方法，提取土壤總DNA并純化；參照王功帥[27]的方法設計特異性引物，采用 CFX96TMThermal Cycler (Bio-Rad) 對不同處理的連作土壤中鐮孢菌的基因拷貝數進行定量分析[28]。

土壤酚酸類物質含量測定：連作土壤風干后過12目篩，稱取80 g風干土壤，加入適量石英砂，于大研缽中混合均勻，按照Wang等[29]的方法進行提取和測定。

生物量的測定：平邑甜茶幼苗株高、徑粗的測定分別使用卷尺、游標卡尺，植株鮮重、干重的測定采用萬分之一天平。

根系形態指標的測定：參照肖宏等[30]的方法，采用專業版WinRHIZO根系分析系統對各樣品根系圖像進行分析處理，記錄幼苗根系平均直徑、總體積、總表面積、根尖數等根系構型參數。

根系呼吸速率的測定：采用氧電極自動測定系統 (Qxytherm System，Hansatech 公司) 測定樣品呼吸速率[31-32]。

根抗氧化酶的測定：超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑 (NBT) 光還原法[33]，過氧化物酶(POD)的活性按Omran等[34]的方法測定，過氧化氫酶(CAT)活性按照Singh等[35]的方法測定。

葉片光合參數的測定：于8月20日 (晴天，無風) 上午9:00選取3株長勢一致植株自上向下第3～5片健康功能葉，采用CIRAS-3便攜式光合儀(PP System，英國) 測定凈光合速率 (Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間 CO2濃度 (Ci)、蒸騰速率 (Tr) 等光合參數。測定內源光強為 450 μmol/(m2·s)，CO2濃度為360 μL/L，葉室溫度為 25℃。

葉綠素含量的測定：采用乙醇浸提法測定葉片葉綠素含量[33]。

1.4 數據分析

試驗數據通過 Microsoft Excel 2010 進行處理，通過SPSS 19.0進行方差分析，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 蚯蚓磨漿發酵產物對連作土壤微生物環境的影響

2.1.1 蚯蚓磨漿發酵產物對土壤微生物總量的影響由圖1可以看出，T2蚯蚓磨漿發酵產物、T3滅菌蚯蚓磨漿發酵產物都能顯著改善連作土壤環境，具體表現為促進了細菌、放線菌數量，降低了真菌數量；T4蚯蚓勻漿顯著降低了真菌數量，但細菌、放線菌數量未顯著提高。T2、T3處理的效果僅次于T1處理，且顯著高于連作對照CK，其中細菌數量分別比CK提高了102.5%和96.3%，放線菌數量分別比CK提高92.5%和83.3%，而真菌數量分別降低了54.5%和39.2%，均達顯著性差異。

圖 1 不同處理土壤微生物數量Fig.1 The number of soil microorganisms under different treatments

2.1.2 蚯蚓磨漿發酵產物對土壤連作有害真菌數量的影響 T2、T3、T4處理均能顯著降低連作土壤中有害真菌的數量，其中T2蚯蚓磨漿發酵產物的效果最為明顯，T2處理中的有害真菌尖孢、層出、腐皮、串珠等鐮孢菌數量相比CK連作對照分別降低了65.6%、13.9%、84.2%和24.1%；T3處理僅次于T2處理，且與T2處理未達到顯著差異，其尖孢、層出、腐皮、串珠等鐮孢菌分別比CK降低了63.4%、22.3%、74.3%和13.55% (表 1)。

表 1 不同處理土壤中鐮孢菌基因拷貝數 (copies/g, soil)Table 1 Gene copies of Fusarium in soils under different treatments

2.2 蚯蚓磨漿發酵產物對連作土壤酚酸類物質含量及平邑甜茶幼苗根系的影響

2.2.1 蚯蚓磨漿發酵產物對連作土壤酚酸類物質含量的影響 由表2可以看出，連作對照和T1處理的酚酸類物質含量明顯高于添加了蚯蚓磨漿發酵產物的處理，同時蚯蚓磨漿發酵產物滅菌與未滅菌的效果差異不大。相較于連作對照CK，T2蚯蚓磨漿發酵產物處理的土壤中根皮苷、根皮素、肉桂酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸含量分別降低了74.2%、48.9%、50.5%、69.7%和67.0%，均達到顯著性差異。

表 2 不同處理下連作土壤中酚酸類物質含量 (mg/kg, dry soil)Table 2 The concentration of phenolic compounds in replanted soil under different treatments

2.2.2 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗根系形態的影響 表3結果表明，與CK相比，T2、T3處理顯著促進了平邑甜茶根系的生長，T4對根系生長的促進作用不明顯。T2、T3處理的根系指標與CK相比均有顯著性差異，T2處理的總根長、表面積、根體積和根尖數分別比CK增加了78.0%、67.7%、88.4%和159.4%；T3處理分別增加了57.1%、40.6%、87.2%和125.2%。

表 3 不同處理下蘋果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 細根發育狀況Table 3 Development of fine roots of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

2.2.3 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗根系呼吸速率和抗氧化酶活性的影響 由圖2可以看出，T2、T3、T4處理均可不同程度地提高平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性，具體表現為 T2 > T3 > T4 >CK；與CK相比，T2處理的SOD、POD和CAT活性分別提高了81.2%、81.1%和161.5%，均達顯著性差異。T2、T3處理也顯著提高了根系呼吸速率，分別比CK提高了69.4%和64.8%。

圖 2 不同處理蘋果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 根系呼吸速率和抗氧化酶活性Fig.2 Respiration rate and antioxidant enzymes activity of roots of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.)under different treatments

2.3 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗生物量及葉片光合參數的影響

2.3.1 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗生物量的影響 由圖3可知，所有處理均不同程度地促進了平邑甜茶幼苗的生長。除T1處理滅菌土外，T2、T3處理效果最為顯著，T2、T3處理的植株干重是連作對照CK的2.58和2.19倍；T4處理蚯蚓勻漿雖促進了植株干重的增加，但與CK未達顯著性差異。

2.3.2 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗葉片光合參數的影響 由圖4可知，除T1處理滅菌土外，T2顯著提高了平邑甜茶幼苗葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率 (Tr) 和氣孔導度 (Gs)，T3 對凈光合速率的影響顯著。與CK相比，T2處理的Pn、Tr和Gs分別提高了46.5%、21.6%和41.0%。各處理間胞間 CO2濃度 (Ci) 值差異不顯著。

圖 4 不同處理蘋果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 葉片的光合參數Fig.4 Photosynthetic parameter in leaves of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

2.3.3 蚯蚓磨漿發酵產物對平邑甜茶幼苗葉片葉綠素含量的影響 除T1處理滅菌土外，蚯蚓磨漿發酵產物T2、T3、T4處理均可不同程度地提高平邑甜茶幼苗葉片的葉綠素含量，其中T2處理的效果最明顯，T3和T4未達顯著性差異。T2處理葉片的葉綠素 a (Chl.a)、葉綠素 b (Chl.b) 和類胡蘿卜素 (Car.)分別是CK的1.38、1.65和1.16倍，均達到顯著性差異 (表 4)。

表 4 不同處理下蘋果幼苗 (M.hupehensis Rehd.) 葉片的光合色素含量 (mg/g，FW)Table 4 The photosynthetic pigment contents in leaves of apple seedlings (M.hupehensis Rehd.) under different treatments

3 討論

微生態系統的綜合功能失調是造成蘋果連作障礙的主要原因[3]，而有害真菌數量的增加則是打破連作土壤中微生態系統平衡的重要原因[9, 11]。Kelderer等[7]的研究表明，尖孢鐮孢菌 (F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌 (F.solani)、柱孢屬真菌 (Cylindrocarponspp.) 和雙核絲核菌 (BinucleateRhizoctoniaspp.) 是引起意大利地區蘋果連作障礙的主要病原菌。同時也有研究表明，導致中國蘋果主產區連作障礙發生的主要原因是鐮孢屬真菌的增多[2]，王功帥[27]對發生蘋果連作障礙土壤中的有害鐮孢菌進行了分離鑒定，結果表明分離的鐮孢菌主要分為尖孢鐮孢菌 (F.oxysporum)、層出鐮孢菌 (F.proliferatum)、腐皮鐮孢菌 (F.solani)和串珠鐮孢菌 (F.moniliforme)。研究發現通過酶解或微生物發酵動植物昆蟲蛋白底物的方法可產生具有生物活性的抗菌小肽，這些小分子肽對微生物有廣譜的抗菌活性，可以有效對抗農業生產中的植物細菌真菌感染[18-19, 36]。本研究中，蚯蚓磨漿發酵產物的添加促進了連作土壤中細菌、放線菌數量的增加，有效降低了真菌數量，qPCR結果顯示蚯蚓磨漿發酵產物有效降低了尖孢、層出、腐皮和串珠4種有害真菌的數量，這對改善蘋果園連作土壤微環境起到了非常積極的作用，該研究結果與Plav?in等[18]的研究結果一致。分析認為，蚯蚓磨漿發酵產物中的某種或某幾種物質對連作土壤中的有害真菌起到了滅殺作用，從而改變了連作土壤微生物環境，但具體為哪種物質起到了抑菌作用及其抑菌機理尚需進一步明確。

大量研究表明，酚酸類物質是引起包括蘋果、人參、西瓜等多種作物發生連作障礙現象的主要因素之一[37-39]。連作障礙的發生與連作土壤中酚酸等化感物質的積累密切相關[40]，當土壤中酚酸類物質積累到一定的濃度時會抑制作物的生長[41]，使作物出現連作障礙現象[42]。本研究發現，蚯蚓磨漿發酵產物的施入明顯降低了蘋果連作土壤中酚酸類物質的含量，這可能是因為蚯蚓磨漿發酵產物對連作土壤微生物環境的影響導致的，在降低有害真菌數量的同時增加了有益菌的菌群數量，使酚酸類物質大量分解。這與姜偉濤等[43]研究中發現的酚酸類物質可與連作致病真菌產生協同效應，根皮苷和串珠鐮孢菌可共同作用，從而加重蘋果連作障礙現象的研究結果一致。

尹承苗等[37]的研究表明，連作土壤中的5種土壤實測濃度的酚酸類物質對平邑甜茶幼苗根系的生長有極大的抑制作用。連作條件下，果樹幼苗的總根長和平均根直徑均會出現不同程度地下降，這些根系指標的下降導致了根系對水分及養分吸收能力的降低，最終使得植株干物質積累量的減少，進而導致作物連作障礙的發生[42]。王樹鳳等[44]的研究也表明，逆境條件下，植物根系生長會受到抑制，進而影響根系在逆境土壤中的分布范圍，影響植物對水分和營養元素的吸收，進而影響植物生長。本研究中，蚯蚓磨漿發酵產物明顯促進了連作條件下平邑甜茶幼苗根系的生長，保證了植株從土壤中對水分和營養元素的正常吸收，有利于植株的正常生長。研究發現，一定濃度的肉桂酸會降低平邑甜茶幼苗根系基礎呼吸速率[31]，而一定濃度的根皮苷可降低三羧酸循環中相關酶活性，致使平邑甜茶根系呼吸速率下降[45]。同時，植物在逆境條件下，活性氧大量積累，SOD、POD和CAT等保護性酶活性卻呈現降低趨勢，使植物體內的抗氧化酶系統與活性氧之間的動態平衡被打破，細胞不能及時清除多余的活性氧而對植物造成傷害[46]。在連作土壤中，由于土壤中微生物環境惡化、酚酸等化感類物質積累及土傳病害加重等原因，致使植物根系內的活性氧大量產生并積累，進而傷害植株根系，影響根系對營養元素和水分的吸收和利用，導致連作障礙的發生[47]。本研究中，添加蚯蚓磨漿發酵產物后，植株根系呼吸速率和根系保護性酶的活性都得到顯著提高，這對促進根系健康生長，提高根系對營養物質的吸收效率、提高植株抗逆性和對連作土壤的適應性，從而促進植株健康生長減輕連作障礙造成的危害具有重要意義[48]。

生物量是表征作物植株生長發育的重要指標，當連作障礙發生時，果樹會出現植株矮小、根系分生能力差、植株生長發育緩慢等現象[4, 10]。而在本試驗中，蚯蚓磨漿發酵產物的施入使平邑甜茶幼苗的株高、徑粗都有明顯提高，同時也促進了干物質量的積累。光合作用是植物的基礎代謝活動，且作物的產量和品質又與光合作用密切相關，光合作用對逆境脅迫非常敏感，任何逆境都會給植物的光合作用造成不利影響。在逆境條件下，植株葉片的凈光合速率和蒸騰速率等光合參數會出現明顯下降[49]。葉綠素是主要的光合色素，在光合作用中具有吸收、傳遞和轉化光能的功能。楊萍等[50]的研究表明，在自毒作用下，葉綠素a、葉綠素b及總葉綠素含量均會明顯降低。本研究中，施入蚯蚓磨漿發酵產物后，植株葉片中的葉綠素含量明顯提高，凈光合速率等葉片光合作用參數也得到有效提高，可能原因是發酵產物中的營養成分被植株吸收促進了植株生長，從而進一步促進了植株光合效率的提高，為植株健康生長提供了有效保障。

4 結論

本研究中，蚯蚓磨漿發酵產物的添加顯著改善了連作土壤微生物環境，降低了連作土壤中酚酸類物質的含量，促進平邑甜茶植株根系生長及根系抗氧化酶活性，提高了植株葉片的葉綠素含量及光合作用效率，促進了連作條件下植株的生長，有效降低了蘋果連作障礙的危害。綜合研究結果可知，蚯蚓磨漿發酵產物可能從改善連作土壤微生物環境和營養成分促進植株生長兩方面緩解了連作障礙造成的危害，但蚯蚓磨漿發酵產物中的何種成分起到關鍵作用及其作用的機制還需進一步探討和研究。