外源谷胱甘肽噴施對缺硫脅迫下小白菜谷胱甘肽代謝的影響

王 丹，汪寬鴻，楊 靜，朱祝軍，祝 彪

（浙江農林大學農業與食品科學學院/浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江杭州 311300）

硫是植物生長發育過程中所必需的營養元素[1-2]，同時也是維生素、多肽 (GSH和PC)、含硫氨基酸(Met和Cys) 以及許多次級代謝產物的重要組成成分[3-4]。增施硫肥能夠有效促進植物光合作用和蛋白質形成，提高農作物產量，改善農產品品質[5]。近年來，南方紅壤地區的硫缺乏現象十分普遍，缺硫脅迫很大程度上阻礙了植物的生長發育，嚴重制約了農業生產[6]。谷胱甘肽 (GSH) 是一種由甘氨酸(Gly)、谷氨酸 (Glu) 和半胱氨酸 (Cys) 縮合而成的三肽化合物[4,7-8]，甘氨酸殘基可以防止GSH被γ-谷氨酰環化轉移酶作用，由谷氨酸的γ-羧基和半胱氨酸的α-氨基縮合而成的特殊肽鍵γ-谷氨酰胺鍵可以保護GSH不被多肽酶水解[4]，半胱氨酸上游離的巰基具有很強的供電子或質子氫的能力[9]。GSH這種特殊的化學結構，使其在植物體內發揮至關重要的作用，參與細胞代謝過程中產生的多余活性氧自由基的清除、過氧化物的還原、對氧化還原敏感信號的傳導[9-13]、與異源有毒物質絡合、調控植物生長發育以及對各種逆境脅迫 (重金屬、干旱、鹽脅迫、病菌侵染) 的抵抗[14-17]。植物細胞中GSH的生物合成分兩步依賴ATP參與的酶催化反應完成。第一步，合成γ-谷氨酰半胱氨酸 (γ-EC)，由L-半胱氨酸和L-谷氨酸在 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (γ-ECs) 催化下反應；第二步，合成GSH，由γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸在GSH 合成酶 (GSH2) 催化下反應[7-8]。其中，γ-ECs(由GSH1基因編碼) 是GSH合成過程中的限速酶，通過最終產物GSH對γ-ECs活性反饋抑制，調控GSH的生物合成[11,18]。研究表明，細胞內總GSH含量在擬南芥細胞和煙草分裂間期G1期到S期過渡過程中顯著增加，在缺失GSH1的擬南芥根尖分生組織細胞分裂間期卻沒有觀察到G1期向S期的轉變[19-20]，在缺失GSH1的擬南芥pad2-1突變體內，GSH含量只有野生型的20%[21-22]。在植物GSH代謝中，有GSH還原酶 (GR)、GSH過氧化物酶 (GPx)、GSH 硫轉移酶 (GST) 3 個關鍵酶[23]。GR 可在NADPH輔酶的催化下將氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 還原成還原型谷胱甘肽 (GSH)，降低植物體內活性氧(ROS) 含量，減輕植物所受的氧化脅迫[24-25]。GPx可以在GSH的參與下，清除機體內的H2O2、過氧化物及脂質過氧化物，保護機體不被ROS進一步損傷[26-28]；GST能夠催化GSH與外源毒素及內源有毒物質結合生成水溶性產物，或者將結合的化合物從細胞質中轉運到液泡中，最終被排除到細胞外[29-31]。

小白菜又稱不結球白菜，俗稱青菜、油菜等，是需硫量較高的作物之一，含有較多的甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等含硫氨基酸以及多種含硫次生代謝產物，對硫缺乏較為敏感[32-33]。目前，關于外源GSH緩解逆境脅迫的研究主要集中在干旱、重金屬以及鹽脅迫等方面，對外源GSH緩解缺硫脅迫的研究尚未見報道。本試驗以小白菜為試材，進行缺硫脅迫和外源噴施GSH、GSSG處理，分析GSH1基因表達量、γ-ECs、GR、GPx、GST活性以及GSH和GSSG含量，從基因表達、酶活性、物質含量層面綜合分析外源GSH和GSSG處理對缺硫脅迫下小白菜GSH代謝途徑的影響，為利用外源GSH減輕植物缺硫脅迫提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

試驗選用的小白菜品種為‘杭州油冬兒’(BrassicarapaL.ssp.Chinensisvar.communis.cv.Hangzhou You Dong Er)，由杭州種子公司提供。試驗于2018年10月和2019年3月在浙江農林大學農學院人工智能氣候室育苗，2018年10—11月和2019年3—4月在浙江農林大學平山基地玻璃溫室營養液栽培。在穴盤中育苗，將小白菜種子播于50孔穴盤基質中 (每孔2～3粒)，待幼苗長至2～3片真葉時，選取長勢一致幼苗，自來水洗去根部基質，隨后移栽到10 L水培箱中 (每箱8株)，所有幼苗先在正常硫濃度營養液 (1 mmol/L，S1) 中生長 2 天，以適應水培環境，2 天后分為正常硫供應 (S1) 和缺硫 (0.02 mmol/L，S0.02) 2 個處理培養。缺硫處理營養液配方中，微量元素和大量元素A試劑與正常硫供應營養液濃度相同，大量元素C試劑中，以MgCl2·6H2O 代替 MgSO4·7H2O 使各處理 Mg2+含量相同，具體如表1所示 (正常硫供應營養液由微量元素、大量元素A和大量元素B試劑組成，缺硫營養液由微量元素、大量元素A和大量元素C試劑組成)。每7 天更換一次營養液，氣泵晝夜不間斷通氣。玻璃溫室最大光照強度653 μmol/(m2·s)，白天溫度控制在18℃～30℃，夜間溫度控制在15℃～18℃。缺硫營養液中栽培17 天 (小白菜長至9～10片真葉) 時進行外源噴施硫處理。試驗共設置正常供硫+噴施蒸餾水對照 (CK)；缺硫處理下，分別噴施蒸餾水 (H2O)、噴施 25 mg/L GSH (GSH)、噴施 25 mg/L GSSG (GSSG)，共4個處理。處理時，小白菜葉表面和背面均需噴施，使葉片上的水珠呈飽和狀態。試驗采用完全隨機區組排列，每個處理重復4次，每個重復3株。分別在處理0、2、4、8、24 h取樣測定基因表達量，在處理0、24、48、72 h取樣測定物質含量及酶活性等生理指標，挑選健康無病害的植株，用錫箔紙包0.3 g干凈新鮮的葉片，液氮冷凍后，保存在–80℃冰箱待測。

表 1 營養液配方Table 1 Composition of nutrient solution

1.2 測定方法

1.2.1 RNA提取、質量檢測以及反轉錄合成cDNA總RNA采用Trizol法提取，氯仿、異丙醇萃取分離，質量檢測及反轉錄合成cDNA均采用TaKaRa公司試劑盒，具體步驟參照何超超[17]的方法。

1.2.2 定量引物的設計以及基因表達量的測定 根據已發表的大白菜 (Bra03675) 和擬南芥(AT4G23100) 的GSH1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性定量引物，上下游引物分別為：GCTTATGTTAGCTCCTACTCC和TATCC TCCATTTGTCCTTT，以白菜肌動蛋白基因 (ACTIN)為內參基因，上下游引物分別為：CGCTTAACCCG AAAGCTAAC和TACGCCCACTAGCGTAAAGA。熒光定量 PCR 反應體系：TB Green 10 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，cDNA 模板 1.6 μL，滅菌水 7.6 μL。PCR 擴增條件：95℃ 30 s (預變性)；95℃ 5 s，60℃ 30 s (40 個循環)；95℃ 5 s，60℃ 30 s(Melt Curve)。用 2?△△Ct法計算基因表達量。

1.2.3 GSH 合成酶 γ-ECs活性的測定 γ-ECs 活性的測定采用上海閎巨實業有限公司提供的試劑盒，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光值，計算樣品活性。

1.2.4 GSH和 GSSG含量的測定 GSH和GSSG含量測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。按照說明書步驟用酶標儀測定405 nm吸光值，計算GSH和GSSG含量。

1.2.5 GSH代謝酶GR、GPx、GST等活性的測定GR活性的測定采用王紹嫻[34]的方法并進行改進。取上述酶液 100 μL，依次加入 25 mmol/L 的 PBS (含0.2 mmol/L EDTA，pH 7.0) 1.7 mL，10 mmol/L 的GSSG 100 μL，最后加入 2.4 mmol/L 的 NADPH 100 μL，混勻后快速轉入2.5 mL比色皿中，動力學方法測定340 nm波長下吸光值，計算其活性。

GPx活性的測定采用何超超等[17]的方法并進行改進。取上述酶液 200 μL，依次加入 25 mmol/L PBS(含 0.2 mmol/L EDTA，pH 7.0) 380 μL，1.14 mol/L NaCl 100 μL，5 mmol/L GSH 100 μL，2 mmol/L NADPH 100 μL，2.5 mmol/L H2O2100 μL，25 U/mL GR 10 μL，混勻后快速轉入 1 mL 比色皿中，動力學方法測定340 nm波長下吸光值，計算其活性。

GST活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。用可見分光光度計在412 nm波長下測定吸光值，計算樣品活性。

1.3 數據分析

采用 Excel 2007和SPSS Statistics 19 軟件對檢測數據進行計算和方差分析，并在0.05水平上進行最小顯著差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 缺硫脅迫下小白菜對外源GSH和GSSG的吸收

如圖1A所示，缺硫脅迫下，GSH含量顯著低于對照，在處理 0 (處理前)、24、48和72 h分別是對照的87%、62%、86%和64%，GSH含量在外源噴施GSH處理后開始上升，在24 h顯著高于H2O處理，隨后回落，48 h后開始上升，72 h顯著高于H2O處理，達到了H2O處理的1.96倍。外源噴施GSSG處理后，缺硫脅迫下小白菜GSH含量較H2O處理在24—48 h短暫下降后逐漸上升，在處理后72 h顯著高于H2O處理，達到了H2O處理的1.4倍。

如圖1B所示，缺硫脅迫下，GSSG含量在外源噴施GSH處理后24、48、72 h始終低于對照，其中，處理后24和72 h達到顯著水平，分別僅為對照的51%和59%，這可能是由于缺硫脅迫下小白菜吸收了外源噴施的GSH，使細胞維持在還原狀態；而GSSG含量在外源噴施GSSG處理后開始上升，在24 h顯著高于對照，隨后開始下降，在72 h顯著低于對照，但和H2O處理沒有顯著差異，說明小白菜吸收了外源噴施的GSSG，細胞內GSSG含量短暫升高，但高濃度的GSSG被GR催化還原成GSH，GSSG含量下降。

圖 1 外源GSH和GSSG對缺硫脅迫下小白菜GSH和GSSG含量的影響Fig.1 Effects of exogenous GSH and GSSG on the content of GSH and GSSG in pakchoi under sulfur deficiency

2.2 外源GSH對缺硫脅迫下小白菜GSH合成的影響

2.2.1 外源GSH對缺硫脅迫下小白菜BcGSH1表達的影響 在 0 h (處理前) 以及 25 mg/L 外源GSH和GSSG分別處理缺硫脅迫下小白菜24 h內的BcGSH1基因表達量見圖2A，缺硫脅迫下小白菜BcGSH1表達量在2和4 h與對照沒有顯著差異，但在0、8、24 h顯著低于對照，僅為對照的35%、51.9%和28.3%。外源噴施25 mg/L GSH后，缺硫脅迫下小白菜BcGSH1表達量顯著上升，在處理后4、8和24 h分別達到了H2O處理的3.51、3.64和4.08倍。缺硫脅迫下小白菜BcGSH1表達量在外源噴施 25 mg/L GSSG 后 4 h 開始上升，在 8和24 h分別達到了H2O處理的4.38和5.79倍。

2.2.2 外源GSH對缺硫脅迫下小白菜葉片γ-ECs活性的影響 圖2B顯示，缺硫脅迫下，γ-ECs活性在0、24、48和72 h均顯著低于對照，在外源噴施GSH處理后，γ-ECs活性呈先上升后下降的趨勢，在處理后24和48 h分別比H2O處理增加了44%和40%，但在處理后72 h與H2O處理差異不顯著；外源GSSG處理后，缺硫脅迫下小白菜γ-ECs活性先上升后下降，僅在處理48 h顯著高于H2O處理，達到了H2O處理的1.4倍，在處理后72 h和H2O處理沒有顯著差異。

圖 2 缺硫脅迫下噴施GSH和GSSG后不同時間小白菜BcGSH1表達量和γ-ECs活性Fig.2 Relative expression of BcGSH1 and activity of γ-ECs in pakchoi at different time after foliar spraying GSH and GSSG under sulfur deficiency

2.3 外源GSH對缺硫脅迫下小白菜GSH代謝的影響

如圖3A所示，缺硫脅迫下，GR活性顯著低于對照，在 0 h (處理前)、處理 24、48和72 h分別是對照的54%、75%、55%和69%。GR活性在外源噴施GSH處理后開始上升，在24、48、72 h 3個時間點都顯著高于H2O處理，分別達到了H2O處理的1.42、1.97和1.44倍；同樣，外源噴施GSSG處理后，GR活性持續上升，在24、48、72 h 3個時間點都顯著高于H2O處理，分別達到了H2O處理的1.60、1.75和1.77倍；說明缺硫脅迫顯著降低了小白菜GR活性，外源噴施GSH和GSSG能夠提高GR活性，在一定程度上提高了小白菜的還原能力。

如圖3B所示，缺硫脅迫下，GPx活性顯著高于對照，這可能是由于缺硫脅迫對小白菜造成了氧化損傷，GPx活性增強，催化GSH與ROS反應，以減輕ROS對小白菜的損傷。外源噴施GSH 24 h后，缺硫脅迫下小白菜GPx活性開始持續上升，在處理后48和72 h達到H2O處理的1.3和1.2倍，這可能是缺硫脅迫下小白菜吸收了外源GSH，細胞內GSH含量增加，有足夠多的GSH以供GPx催化來清除ROS以應對缺硫脅迫。外源噴施GSSG后，GPx活性反而下降，在處理后72 h僅為H2O處理的62%。

如圖3C所示，缺硫脅迫下，GST活性顯著低于對照，在處理 0 (處理前)、24、48和72 h 僅為對照的58%、48%、67%和64%，這可能是由于缺硫脅迫下，GSH含量較低，缺乏GSH參與解毒過程，因此GST活性較低。外源噴施GSH后，缺硫脅迫下小白菜GST活性開始上升，在24、48、72 h 3個時間點都顯著高于H2O處理，分別比H2O處理增加了37%、42%、50%，說明缺硫脅迫下小白菜吸收了外源噴施的GSH，GSH含量上升，導致GST活性增強，催化GSH合成其他絡合物；同樣，GST活性在外源GSSG處理后開始上升，在24、48、72 h 3個時間點都顯著高于H2O處理，分別達到了H2O處理的1.48、1.27和1.52倍，這可能是缺硫脅迫下小白菜吸收了外源噴施的GSSG后，GSSG被GR還原成GSH，高濃度的GSH供GST催化參與代謝。

圖 3 外源GSH和GSSG對缺硫脅迫下小白菜GR、GPx和GST活性的影響Fig.3 Effects of exogenous GSH and GSSG on the activity of GR, GPx and GST in pakchoi under sulfur deficiency

3 討論

硫是植物生長發育過程中所必需的營養元素，缺硫將阻礙植物體內蛋白質合成，限制植物生長，導致植物對病蟲害的抵抗力以及逆境脅迫的耐受性降低，影響農作物的產量與利用價值[35-37]。GSH在清除ROS、還原硫的儲存和轉運、調節酶活性、調節植物對氧化還原敏感信號的傳導[10-13]、抵抗各種逆境脅迫 (重金屬、干旱、鹽脅迫、病菌侵染) 等方面都發揮著重要作用[14-17,28]。本試驗結果發現，缺硫脅迫會顯著降低小白菜GSH合成基因BcGSH1表達量、γ-ECs活性、GSH含量以及GSH關鍵代謝酶GR和GST的活性，但會引起GPx活性顯著增強，說明缺硫脅迫下，硫酸鹽缺乏，進入小白菜初生硫代謝的合成原料減少，小白菜谷胱甘肽合成關鍵基因BcGSH1表達量降低，GSH合成關鍵酶γ-ECs活性降低，GSH合成受阻，GSH含量顯著降低，小白菜ROS清除能力降低，GR活性下降，以GSH為底物的GST活性也隨之降低，而GPx活性增強，催化GSH反應生成GSSG，清除機體內的H2O2、過氧化物及脂質過氧化物，保護機體不被ROS進一步損傷。袁園園[38]在水稻缺硫脅迫應答機理研究中發現，缺硫處理15天后，水稻幼苗GSH含量、POD、CAT、SOD活性顯著下降；高可輝等[39]在水稻幼苗上開展的缺硫處理相關研究發現，缺硫處理7天后，水稻幼苗GSH含量顯著下降，以GSH為底物的GST活性也隨之下降，而在缺硫預處理加鎘脅迫處理的水稻幼苗中，GST活性則大幅上升，催化GSH與鎘結合，具備了GPx的抗氧化功能，為鎘脅迫帶來的氧化脅迫緩解提供了一條途徑；Wyrwicka等[40]在酸雨處理對黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響研究中發現，黃瓜受到酸雨脅迫的第5天，GPx活性較低，GST活性顯著提高，GPx和GST同為GSH代謝中的保護酶，變化恰好相反，可能二者之間存在代謝補償機制。此外，雖然GPx和GST都有清除過氧化物的功能，GPx催化還原H2O2和有機氫過氧化物，而GST則不能分解H2O2，只能催化GSH的巰基與一些親電子類物質結合[41]，因此，缺硫脅迫下GSH含量降低，以GSH為底物的GST活性也降低。

在外源噴施25 mg/L的GSH后，缺硫脅迫下小白菜GSH合成關鍵基因BcGSH1表達量和GSH合成關鍵酶γ-ECs活性升高，GSH含量短暫上升后下降，隨后又上升，在72 h顯著高于H2O處理(圖1A)，說明缺硫脅迫下的小白菜吸收了外源GSH，小白菜體內GSH含量恢復后，開始參與正常代謝而被消耗，GSH含量下降，48～72 h，脅迫得到緩解或者消失后，GSH含量開始恢復，在72 h顯著高于H2O處理。缺硫脅迫下小白菜GR、GPx和GST活性在外源GSH處理后隨著時間的延長持續升高 (圖3)，其中，GR和GST活性始終高于H2O處理，且GST活性在48和72 h與對照沒有顯著差異 (圖3A和B)，說明外源噴施GSH能夠作為硫素來源補充小白菜體內的GSH，提高抗氧化酶活性，短暫緩解缺硫脅迫對小白菜造成的氧化損傷。在外源GSH處理48h時，GR活性顯著高于H2O處理，GR可以將GSSG還原成GSH，而GSSG含量無差異，GSH含量下降，這可能是由于缺硫脅迫也會導致氧化損傷，雖然GR活性升高能夠合成更多的GSH，GSH除了直接清除ROS自由基，還參與了由抗壞血酸-GSH循環、GSH氧化物循環等清除ROS自由基[42]，因此GSH大量消耗，含量下降，脅迫得到緩解或者消失后，GSH含量開始恢復，在72 h顯著高于H2O處理。于威等[13]對自毒作用下嫁接黃瓜幼苗的研究發現，施加適宜濃度的GSH能夠增強黃瓜幼苗抗氧化酶活性，提高抗氧化劑含量，緩解ROS對細胞造成的傷害。魯麗麗等[43]對二色補血草的研究表明，外源GSH處理可以明顯增強NaCl脅迫下補血草SOD、CAT、GR和APx活性，提高GSH含量，降低膜脂過氧化水平，緩解鹽脅迫對補血草造成的傷害。周艷等[44]的研究表明，NaCl脅迫下，番茄幼苗葉片抗氧化酶SOD、CAT和APx活性在外源噴施GSH后上調，GSH提高了番茄幼苗植株滲透調節能力及清除ROS的酶促系統的防御能力，能夠保護膜結構和功能的完整性，從而有效緩解鹽脅迫對番茄幼苗生長的抑制。

在外源噴施25 mg/L的GSSG后，缺硫脅迫下小白菜BcGSH1表達量在處理4 h后開始上升，γ-ECs活性在處理24 h后開始上升，而GSH含量在處理24 h后開始下降，48 h顯著低于對照，隨后上升(圖1)，這可能是外源噴施的GSSG加劇了小白菜細胞內缺硫脅迫造成的氧化損傷，細胞內GSH被消耗，而高濃度的GSSG在GR催化下還原成GSH，以維持細胞內GSH庫在還原狀態。缺硫脅迫下小白菜GSSG含量在處理開始后上升，24 h顯著高于對照，隨后回落，GR和GST活性開始持續上升，始終高于H2O處理，其中GR在48 h與對照一致，24和72 h顯著高于對照，GST活性在48和72 h與對照一致，而GPx活性在GSSG處理開始后沒有顯著變化，在48 h后開始下降，說明外源GSSG處理后，缺硫脅迫下的小白菜吸收了外源GSSG，細胞內GSSG含量升高，缺硫脅迫造成的氧化狀態加劇，誘導GR和GST活性升高，GR催化GSSG轉化為GSH，而GPx活性下降，減少催化GSH轉化為GSSG，以維持GSH庫在還原狀態。陳鵬等[45]在外源抗氧化劑處理降解番茄體內殘留百菌清的研究中發現，外源GSSG預處理顯著增加了百菌清處理后番茄葉片GSSG含量，也促進植株GSH的合成與積累，同時還有效的激發了GR的活性，但是，番茄葉片百菌清殘留量和ROS含量均與對照沒有顯著差異，很有可能是由于外源GSSG處理沒有激發植物體內部GSH相應的解毒機制。劉會芳等[46]發現外源噴施GSSG雖然造成鹽脅迫下番茄幼苗葉片內源GSSG的大量積累，但其誘導了AsA-GSH 循環關鍵酶活性提高，進而能夠在一定程度上緩解番茄幼苗所遭受的鹽脅迫。

4 結論

缺硫脅迫顯著降低了小白菜BcGSH1表達量、GSH含量及γ-ECs、GR和GST活性，誘導GPx活性增強。外源噴施適宜濃度的GSH和GSSG可以補充小白菜內源GSH和GSSG，小白菜體內GSH和GSSG含量上升后，開始緩解缺硫脅迫而參與代謝被消耗；脅迫得到緩解或者消失后，GSH含量開始恢復上升。外源噴施GSH還會誘導細胞內GSH代謝3個關鍵酶GR、GPx和GST活性增強；而外源噴施GSSG則誘導GR和GST活性增強，GPx活性降低，維持細胞不被繼續氧化，緩解因缺硫脅迫對機體造成的損傷。