覆蓋作物對獼猴桃園土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

張玲玲，李青梅，賈夢圓，張艷軍，趙建寧，楊殿林，王華玲，王 慧*

（1 農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191；2 十堰市經濟作物研究所，湖北十堰 442000）

覆蓋作物一般指除目標作物外被人為種植的草本植物，用作雜草的控制或裸露地面的覆蓋。果園行間種植覆蓋作物是可持續農業系統中一種被廣泛使用的有益管理模式[1-2]，可以提高水分滲透[3]，改變土壤溫度[4]，減少徑流及土壤侵蝕[5]，減少氮浸出[6]，控制雜草和害蟲。覆蓋作物品種通常選擇一年生或多年生豆科或禾本科草本植物，如白三葉草 (Trifolium repensL.)、毛葉苕子 (ViciavillosaRoth)、黑麥草(LoliumperenneL.) 和高羊茅 (FestucaelataKengexE.Alexeev) 等，其具有較強的生物固氮能力、耐陰、耐踩踏、能誘引益蟲及較短的生育期等特性[7]。

近年來，覆蓋作物對土壤理化性質和微生物群落的影響受到廣泛關注。有研究表明，果園種植覆蓋作物后能夠有效改善園區地溫和氣溫，提高園區空氣相對濕度，增強土壤保水能力，通過土壤理化性質的改善，影響土壤微生物的生長環境條件[8]。微生物在氮循環過程中起著重要作用，作為氮循環的關鍵步驟，硝化作用能夠將銨態氮轉化成硝態氮，其第一步和限速步驟是由氨氧化微生物 (氨氧化古菌AOA和氨氧化細菌AOB) 完成的氨氧化過程[9]。土壤生態系統中，硝化因子和硝化速率與植被類型、位置和環境條件有著緊密聯系[10]。植物種類和覆蓋類型對土壤性質和微生物性質有著根本性的影響[11]，植物 [如寬葉蒿 (ArtemisialatifoliaL.)、白刺 (Nitraria sibirica)和豬毛菜 (Salsolaferganic)]是改變微生物群落的驅動因素，植物可能通過其有機質輸入和對硝化潛勢的影響，改變氨氧化微生物的群落組成[12]。因此，種植不同種類或組合種植覆蓋作物可能對土壤氨氧化微生物群落產生不同的影響。

目前，關于覆蓋作物的研究主要集中在覆蓋作物單種對果園節肢動物多樣性、土壤水肥流失、土壤理化性狀[12]、果園小氣候[13]等方面的影響，并且在蘋果園[14]、桃園[15]、梨園[16]應用較多。而針對獼猴桃園豆科與禾本科覆蓋作物混播處理下硝化作用 (連接固氮作用和反硝化作用) 的研究較少。硝化作用不僅反映了植物對氮素的利用狀況，還能反映因過量施用化肥引起的土壤酸化和硝酸鹽淋失所引起的水體污染及氧化亞氮 (N2O) 釋放等一系列環境問題[17]。因此，以獼猴桃果園為研究對象，通過設置不同覆蓋作物處理模式，研究其對土壤氨氧化微生物基因豐度、群落多樣性及組成的影響，其結果將為探索覆蓋作物對氮循環過程的影響機制提供理論指導，并對果園覆蓋作物生態研究、果園高效覆蓋作物利用技術的推廣及示范應用提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗地位于湖北省十堰市農業科學院西溝鄉獼猴桃基地 (32°37'10''N，110°38'2''E)，該地區屬亞熱帶大陸性季風氣候，海拔550 m，年降雨量800 mm，無霜期244 天，年平均氣溫15℃。該基地的果樹品種為樹齡一致、生長整齊的5年生金魁獼猴桃，株行距為 2.5 m×4.5 m。試驗地土壤質地為砂壤土，本底基本理化性質：有機質10.77 g/kg、全氮0.39 g/kg、pH 6.65。

供試覆蓋作物包括白三葉草 (TrifoliumrepensL.)、毛苕子 (ViciavillosaRoth)、黑麥草 (Lolium perenneL.) 和高羊茅 (FestucaelataKengexE.Alexeev)。白三葉草和毛苕子為豆科綠肥，黑麥草生物量大，高羊茅控制雜草能力強[18]。試驗采用隨機區組試驗設計，共設置5個處理：1) 單種白三葉草(W)；2) 白三葉草+黑麥草混種 (WR)；3) 白三葉草+黑麥草+毛苕子混種 (WRV)；4) 白三葉草+毛苕子+黑麥草+高羊茅混種 (WRVF)；5) 清耕對照(CK)。各處理在區組中隨機排列，共3個區組，即每個處理3次重復。覆蓋作物于2017年9月進行行間播種，每個小區總播種量為4 g/m2，豆科與禾本科混播比例為2∶3且同一科覆蓋作物播種比例為1∶1，覆蓋作物距獼猴桃樹0.5 m。每年4月份和7月份的雨季分別撒施硫酸鉀復合肥2.58 kg和尿素710 g，其中硫酸鉀復合肥N、P2O5、K2O 的質量比為14∶16∶15，尿素含氮46%，即每個小區的施氮量為80 kg/hm2。試驗小區呈矩形，長43 m、寬2 m，面積為86 m2。覆蓋作物每年刈割2～3次，將其覆蓋于獼猴桃樹行間自然腐解，清耕區定期進行人工除草。各處理區的生態條件和田間管理措施保持一致。

1.2 植物和土壤樣品采集

2019年11月采集植物和土壤樣品。每個小區隨機選取3個1 m×1 m的樣方，采集樣方內植物地上部。同時，用直徑5 cm的土鉆在每個小區以“S”形采集10鉆0—20 cm耕層土壤，混合后剔除土壤中可見的石塊和動植物殘體，分成兩部分放入塑封袋中帶回實驗室，一部分土樣放入帶有冰袋的盒子，用于分子生物學分析、硝化潛勢及含水量的測定；另一部分土樣風干過篩后用于土壤基本理化性質的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 植株生物量和土壤理化性質分析 植物地上部在 65℃下烘干至恒重，稱重記為地上部生物量。新鮮土樣在105℃烘箱中烘干12 h測定土壤含水量。使用AA3流動分析儀 (SAN++，Skalar，Holland) 測定鮮土銨態氮 (NH4+-N) 和硝態氮 (NO3–-N)含量。利用 pH 計 (Delta 320，Mettler-Toledo Instruments Co.，Shanghai，China) 以土水比 1∶2.5(g/mL) 測定土壤pH。采用常規重鉻酸鉀容量法—外加熱法，測定土壤有機碳含量。采用硫酸消煮—凱氏定氮法測定土壤全氮含量。

1.3.2 土壤硝化潛勢的測定 通過測定短期內土壤硝化速率估算土壤硝化潛勢是評價土壤硝化活性的方法之一，本研究參考Yao等[9]的方法并略有改進。采用懸浮液培養法，培養基中含有1 mmol/L (NH4)2SO4的磷酸鹽緩沖液 (PBS)[19]。稱取10.0 g新鮮土壤置于250 mL白色塑料瓶中，每種土壤3個重復。向白色塑料瓶中分別加入120 mL的液體培養基，置于搖床上 (180 r/min) 振蕩培養 24 h。培養期間，分別于 2、4、16、22和24 h采集20 mL搖勻的土壤懸浮液，過定量濾紙，濾液在–20℃保存，使用AA3流動分析儀 (SAN++，Skalar，Holland) 測定 NO3–-N及NH4+-N濃度。

土壤硝化潛勢計算以培養時間為橫坐標、提取液中NO3–-N含量為縱坐標，求出斜率，即可得單位時間內NO3–-N含量的增長速率。計算公式如下：

Np=R×(0.12 +V1)×24/m[20]

式中：Np為土壤硝化潛勢[mg/(kg·d)]；R為NO3–-N含量的增長速率[mg/(L·h)]；0.12為緩沖液體積(L)；V1為土壤樣品中水分體積 (L)；m為烘干土質量 (kg)。

1.3.3 土壤DNA提取和實時定量PCR 稱取0.3 g凍干土，按照 DNeasy? PowerSoil? Kit試劑盒(Promega，USA) 所提供的方法提取土壤DNA。DNA的濃度和純度采用NanoDrop分光光度計(NanoDrop Technologies，USA) 測定。AOA-amoA和AOB-amoA的定量測定在iCycler iQ5儀器(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA) 上完成，所用的引物序列如表1所示。AOA-amoAqPCR反應條件[21]：95℃ 預變性 5 min；95℃ 變性 30 s，60℃ 退火 45 s，72℃延伸30 s，38個循環。AOB-amoAqPCR反應條件[22]：95℃ 預變性 30 s；95℃ 變性 30 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 30 s，40 個循環。采用 SYBR Green染料法進行熒光定量PCR，反應體系為20 μL，包括 2 μL DNA 樣品，1 μL 上下游引物 (10 μmol/L)，10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，其余用 RNase-Free ddH2O補足。各基因都在延伸階段收集熒光，得到CT值。各樣品重復3次。

利用標準曲線法計算基因拷貝數。用含AOA-amoA和AOB-amoA基因的重組PGEM-T載體為標準質粒。計算出標準質粒的拷貝數，按10倍濃度梯度稀釋，以10–2～10–7濃度梯度稀釋的標準質粒進行熒光擴增，設置陰性對照。以標準質粒拷貝數的log值為橫坐標，不同濃度梯度質粒的CT值為縱坐標，建立標準曲線。本試驗AOA-amoA和AOB-amoA基因的擴增效率分別為93.6%、91.7%，R2>0.99。

1.3.4 末端限制性片段長度多態性 (T-RFLP) 土壤DNA的PCR擴增引物如表1所示，其中正向引物的 5’末端用 6-carboxyfluorescein (FAM) 標記。AOA-amoAT-RFLP反應條件[21]：94℃預變性5 min；94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，35個循環。AOB-amoAT-RFLP 反應條件[22]：94℃ 預變性 3 min；94℃ 變性 30 s；53℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 1 min，30 個循環。用 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒 (Promega，USA) 對PCR產物進行純化。選取適當的限制性內切酶酶切純化后的產物，即AOA-amoA基因和AOB-amoA基因采用的內切酶分別是HhaI (TaKaRa Biotechnology，Japan)和MspI (Takara Biotechnology，Japan)。AOA的酶切體系為20 μL，包括7 μL 滅菌超純水，2 μL 10×M buffer，10 μL DNA，1 μLHhaⅠ；AOB 的酶切體系為 20 μL，包括 5 μL 滅菌超純水，2 μL 10×T buffer，2 μL 0.1% BAS，10 μL DNA，1 μLMspⅠ。酶切時間為 6 h。

酶切樣品送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司，使用 ABI Prism 3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems，USA) 進行毛細管電泳，檢測酶切片段。使用 GeneMarker軟件 (SoftGenetics，USA) 分析得到的圖譜。末端限制性片段(terminal restriction fragments, T-RFs)的相對豐度用每個片段的峰面積除以總的峰面積表示。

1.3.5 克隆測序與系統發育樹分析 使用ArchamoAF/Arch-amoAR和amoA-1F/amoA-2R 引物 (表 1)分別對每個樣本中AOA和AOB的amoA基因進行PCR 擴增。PCR 反應 (50 μL) 包含 4 μL DNA 樣品，2 μL 上下游引物 (10 μmol/L)，5 μL 10×buffer，4 μL dNTPs，0.5 μL TaqHs，其余用 RNase-Free ddH2O 補足。將AOA和AOB的PCR產物單獨混合，分別構建混合的AOA和AOB克隆文庫。混合PCR產物用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 試劑盒(Promega，USA) 進行凝膠純化。純化后的PCR產物連接到 PGEM-T Easy Vector (Promega，USA) 中，然后轉化到大腸桿菌 JM109 (Takara Biotechnology)。從AOA和AOB克隆文庫中分別隨機選取120和170個陽性克隆進行測序，并對所得序列利用ClustalX2和Mothur軟件進行同源性分析，顯示超過97%的一致性序列被劃分為相同的操作分類單位(OUT)，每個OTU的代表性序列與NCBI BLAST比對分析，獲取相近典型菌株的基因序列。利用MEGA5.0 中的鄰接法 (Neighbor-Joining) 進行系統發育分析。

表 1 氨氧化微生物功能基因的引物及序列Table 1 Primers and sequences of ammonia-oxidizing microorganism functional genes

1.4 數據處理

微生物群落多樣性指數按如下公式進行計算：

豐富度指數 (S)=物種數

香農-維納多樣性指數 (Shannon-Weinner指數，H')=–∑(Pi×lnPi)

式中，Pi為第i個物種相對豐度。

均勻度指數 (Pielou 指數，E)=H'/(lnS)

使用SPSS 22.0軟件，對植物地上部生物量、土壤理化性質、AOA-amoA和AOB-amoA基因拷貝數以及群落多樣性指數進行單因素方差分析與Pearson相關性分析。使用Canoco 5軟件，對土壤理化性質和AOA-amoA、AOB-amoA基因群落結構進行冗余分析 (redundancy analysis，RDA)。利用 Mega 5.0 構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 不同覆蓋作物處理模式對土壤理化性質、硝化潛勢及地上部植物生物量的影響

如表2所示，WR模式顯著提高了土壤銨態氮和硝態氮含量以及土壤含水率，同時降低了土壤pH。不同覆蓋作物種植模式下土壤硝化潛勢提高，變化范圍 4.54～7.73 mg/(kg·d)，且在 W 模式下最高，與CK對照相比提高了121.49%。不同覆蓋作物種植模式對植物地上部生物量、土壤有機質、全氮含量影響不顯著。

表 2 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤理化性質 (n=3)Table 2 Physiochemical properties in soils of kiwifruit orchard under different cover crops

2.2 不同覆蓋作物處理模式對土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度的影響

圖1顯示，覆蓋作物種類對土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因豐度的影響不同。土壤AOA-amoA基因豐度范圍為 1.86×105～2.75×105個拷貝數/g，W處理的AOA-amoA基因豐度最高，比CK顯著提高了2.85%，WR、WRV及WRVF處理的AOA-amoA基因豐度也有一定的增加，但與CK間差異沒有達到顯著水平。土壤AOB-amoA基因豐度范圍為 2.00×104～4.40×104個拷貝數/g，W 和WR處理的AOB-amoA基因豐度比CK分別增加了4.95%、6.42%，WRV和WRVF兩個處理的AOB-amoA基因豐度沒有顯著變化。

圖 1 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因的豐度Fig.1 Abundance of AOA-amoA gene and AOB-amoA gene in kiwifruit orchard soils under different cover crops

2.3 不同覆蓋作物處理模式對土壤氨氧化古菌(AOA) 與氨氧化細菌 (AOB) 群落結構的影響

2.3.1 末端限制性片段長度多態性 (T-RFLP) 分析如圖2所示，相對豐度不到1%的未參與計算，相差為 ± 1 bp的片段為同一T-RF，大于10%的TRFs為優勢片段[23]。AOA基因經過酶切主要得到5個末端限制性片段 (T-RFs)，其中165、267、542、635 bp所代表的T-RFs片段為優勢片段，在W、WR模式中片段542 bp的百分含量顯著升高，在WRV和WRVF模式中，片段635 bp的百分比含量顯著降低，說明不同T-RFs所代表的AOA在不同種植模式中所占比例發生改變，但AOA群落結構未發生明顯改變。AOB經過酶切主要得到3個末端限制性片段 (T-RFs)，分別是 T-RFs 55、155、234 bp，W處理的土壤中未檢測到T-RFs 55 bp片段，且234 bp 片段的百分含量顯著升高 (P< 0.05)，而 WR、WRV、WRVF模式均檢測到T-RFs 55、155、234 bp片段，這說明不同T-RFs所代表的AOB在不同種植模式下發生變化，其氨氧化細菌 (AOB) 群落結構可能發生改變。

圖 2 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of T-RFs of AOA-amoA gene and AOB-amoA gene in kiwifruit orchard with different cover crops

覆蓋作物處理對土壤AOA多樣性指數和均勻度指數以及AOB多樣性指數有顯著性影響（表3）。WR處理顯著降低了AOA的多樣性指數，WR和WRVF處理顯著降低了AOA均勻度指數，而WRV和WRVF模式顯著提高了AOB的多樣性指數。

表 3 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤氨氧化微生物群落多樣性指數Table 3 Ammonia-oxidizing microbial community diversity index in kiwifruit orchard with different cover crops

2.3.2 克隆測序及系統發育樹分析 從混合AOA和AOB克隆文庫中分別隨機選取120和170個陽性的AOA和AOB克隆進行測序。最終分別獲得107和165條可用的AOA和 AOB序列，分別被劃分為21和7個OTUs。利用Mega軟件對AOA和AOB各自所有的OTUs及已知序列進行系統發育樹的構建(圖3)，結果表明覆蓋作物下獼猴桃園土壤AOA為Nitrososphaera(44.2%)和Nitrosotalea(45.8%)，其中屬于Nitrososphaera的片段包括T-RFs 165、255、267、542、635 bp，而 T-RFs 255、542、635 bp 剩余部分屬于Nitrosotalea，不同覆蓋作物種類處理AOA兩個菌屬的豐度與克隆文庫沒有顯著差異。覆蓋作物下獼猴桃園AOB為Nitrosospira(96.98%) 和Nitrosomonas(3.02%)，其中屬于Nitrosospira的片段有 T-RFs 155、55、234 bp，而 T-RFs 55、234 bp 剩余部分屬于Nitrosomonas，每個處理中均含T-RFs 234 bp片段，不同覆蓋作物處理AOB的群落組成沒有顯著差異。

圖 3 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤氨氧化古菌 (AOA) 和氨氧化細菌 (AOB) 系統發育樹Fig.3 Phylogenetic trees of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB)in kiwifruit orchard with different cover crops

2.4 土壤理化性質、硝化潛勢、土壤氨氧化微生物群落多樣性的相關分析

對土壤理化性質、硝化潛勢與土壤微生物群落多樣性進行Pearson分析 (表4)，結果表明AOA-amoA基因豐度與土壤全氮含量呈顯著正相關，AOA 多樣性指數 (H′)分別與土壤 NO3?-N含量和土壤含水率呈顯著正相關和負相關，AOA均勻度指數(E) 與土壤 NH4+-N含量和土壤有機質含量呈顯著正相關。AOB-amoA基因豐度與土壤有機質、全氮含量及硝化潛勢 (Np) 呈顯著正相關，而其它3個多樣性指數與測定的土壤性狀無顯著相關性。

表 4 氨氧化微生物多樣性與土壤理化性質間的相關性分析Table 4 Correlation analysis of ammonia-oxidizing microorganisms diversity and soil physicochemical properties

微生物群落多樣性和土壤理化性質的關系應用冗余分析 (RDA)，結果 (圖 4) 表明，軸一和軸二對AOA-amoA基因群落結構的解釋量分別為38.54%和4.64%，WR模式分布在第二象限，基因群落結構主要受土壤含水率、銨態氮、硝態氮和有機質含量影響。軸一和軸二對AOB-amoA基因群落結構的解釋量分別為52.11%和0.89%，軸一明顯的區分了CK和WRVF模式，而WR與CK模式下基因群落結構更為相似，且土壤pH (P=0.016) 對AOB-amoA基因群落結構有顯著性影響。

圖 4 不同覆蓋作物下獼猴桃園土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因群落結構和環境因子的冗余分析Fig.4 Biplot of redundancy analysis (RDA) on relationship between environmental factors and community structure of AOA-amoA gene and AOB-amoA gene in kiwifruit orchard with different cover crops

3 討論

植物通過根系吸收土壤養分，不同植物吸收利用養分的情況不同。有研究表明，果園種植不同覆蓋作物、種植覆蓋作物的時間長短以及生態環境的差異都會對土壤養分狀況產生影響[24]。孫霞等[25]的研究結果表明，2年豆科覆蓋作物種植能夠提高酸性土壤有機質、速效氮含量及土壤含水率，但土壤全氮含量卻有所下降且pH變化并不明顯。焦潤安等[26]的研究結果表明，3年自然生草提高了堿性土壤有機質含量，降低了土壤pH；而李華等[27]的研究結果表明，1年或者2年的覆蓋作物種植均提高了堿性土壤pH。潘介春等[28]的研究結果表明，短時間覆蓋作物種植降低了酸性土壤全氮含量及pH，并提高了土壤含水率。本研究中，WR模式顯著提高了土壤含水率 (P< 0.05)，而其他3種種植模式的土壤含水率與CK 沒有顯著性差異 (P> 0.05，表 2)。與前人研究結果不盡一致，可能原因在于單種白三葉草不能完全覆蓋裸露地面，導致土壤蒸發量較高；隨著覆蓋作物種類和地表覆蓋度提高到一定程度，土壤蒸散量降低，有利于穩定土壤墑情，土壤含水量相對較高。本研究中，WR 模式顯著降低了 pH (P< 0.05)，而其他3種種植模式與CK相比無顯著性差異，與前人研究覆蓋作物種植降低土壤pH以及pH變化不明顯的研究結果一致，造成這種現象的原因可能在于不同的覆蓋作物在腐解過程中釋放了不同含量的堿性物質[29]。土壤中的速效養分受耕作措施的影響很大，如施肥量、地面植被類型等都會對土壤中銨態氮和硝態氮等的含量產生直接影響，豆科植物可以通過固氮作用增加土壤中的銨態氮，不同豆科植物的固氮能力不同，已有研究表明紫花苜蓿固氮能力要高于白三葉草和毛苕子[15, 30]，而本研究中混種白三葉草+黑麥草區域土壤銨態氮含量顯著高于混種白三葉草+黑麥草+毛苕子的區域 (P< 0.05)，可能原因在于：1) 白三葉的固氮能力要高于毛苕子[31]；2)WR模式下的土壤固氮能力高于WRV模式下，不同的覆蓋作物會產生不同的土壤固氮菌群[32]。

植被類型影響土壤環境因子 (土壤pH、土壤銨態氮和土壤有機質含量)，而氨氧化微生物對土壤環境因子具有特異的選擇性，因此土壤環境因子的變化會對氨氧化過程乃至整個氮循環產生影響[33]。硝化潛勢在一定程度上可以反映土壤環境中氨氧化微生物的活性[34]。Souto等[35]的研究結果表明，植物分泌的酚類化感物質能夠刺激氨氧化微生物的活性，進而影響了氨氧化微生物群落結構。在本研究中，種植不同的覆蓋作物，土壤硝化潛勢會稍有不同，W模式顯著提高了土壤硝化潛勢和AOA-amoA、AOB-amoA基因豐度 (P< 0.05)，而 W 模式和 CK 對照模式下的土壤理化因子沒有顯著性差異 (P>0.05)，可能原因在于白三葉草根系分泌物對氨氧化古菌 (AOA) 和氨氧化細菌 (AOB) 的活性具有促進作用，進而影響不同覆蓋作物處理下土壤硝化潛勢，植物群落和土壤養分循環的互作關系通常是通過進入土壤中的根系分泌物和植株凋落物來實現的[36]。

前人研究結果表明，在酸性土壤中氨氧化古菌(AOA) 起主導作用，在中堿性土壤中氨氧化細菌(AOB) 起主導作用。Jia等[37]通過微宇宙、分子指紋圖譜及DNA同位素探針技術等試驗方法，發現中性土壤環境中氨氧化細菌 (AOB) 占主導地位；Xia等[38]通過DNA探針同位素標記微宇宙試驗表明，堿性土壤環境中氨氧化細菌 (AOB) 占主導地位；Zhang等[39]的研究結果表明，酸性土壤環境中氨氧化古菌(AOA) 占主導地位且AOA-aomA基因豐度與硝酸鹽濃度顯著正相關。本研究中，土壤pH始終在6.7附近，且Pearson相關分析發現AOA-amoA基因豐度與土壤硝化潛勢無顯著關系，而AOB-amoA基因豐度與土壤硝化潛勢顯著正相關，說明氨氧化細菌(AOB) 在本試驗中性土壤環境中占主導地位，同時曾有研究發現在農業土壤中雖然氨氧化古菌 (AOA)基因豐度顯著高于氨氧化細菌 (AOB) 基因豐度，但是起主導作用的是氨氧化細菌 (AOB) 而不是氨氧化古菌 (AOA)[37]，本研究與前人研究結果一致。WR模式顯著提高了 AOB-amoA基因豐度 (P< 0.05)，而AOA-amoA基因豐度無顯著性變化 (P> 0.05)，造成這一結果的原因可能在于：1) 在中性土壤中，AOA-amoA基因豐度盡管在土壤中保持很高的水平，但氨氧化細菌 (AOB) 對氨的響應更為敏感；2) 研究發現，影響氨氧化微生物豐度的并非植被的種植，而是土壤養分含量的變化[40]，WR模式顯著提高了土壤銨態氮和硝態氮含量，而低銨態氮環境有利于氨氧化古菌(AOA) 的生長，高銨態氮環境有利于氨氧化細菌(AOB) 的生長[41]，故進而影響了AOB-amoA基因豐度；3) 土壤水分在調節氨氧化微生物群落結構方面起著重要作用，能夠緩解水分壓力[42]，有利于氨氧化細菌 (AOB) 的生長[43]。Zhou 等[44]對紫色土的研究得出，氮和磷可能是影響氨氧化細菌 (AOB) 群落組成和土壤硝化潛勢的重要因素，而土壤pH可能對紫色土壤氨氧化古菌 (AOA) 群落結構和硝化潛勢起重要作用。Bao等[45]對北運河沉積物的研究表明，土壤全氮、有機質、銨態氮和pH是影響氨氧化微生物群落結構的重要因素。在本研究中，Pearson相關分析發現，氨氧化古菌 (AOA) 多樣性指數分別與硝態氮(NO3–-N) 含量和土壤含水率呈顯著正相關和負相關(P< 0.05)，并且RDA分析發現土壤pH顯著影響氨氧化細菌 (AOB) 群落組成，而對氨氧化古菌 (AOA)群落結構的影響不顯著，由此說明由覆蓋作物種植引起的土壤理化性質變化是導致氨氧化微生物群落結構顯著變化的主要因素。

本研究結合各處理的T-RFLP結果分析，WR模式下優勢片段T-RFs 542 bp所代表的優勢菌群數量顯著升高，同時顯著降低了氨氧化古菌 (AOA) 多樣性和均勻度指數，可能原因在于T-RFs 542 bp所代表的優勢菌群的生長抑制其他氨氧化菌群的生長[46]。在不同種植模式中AOB-amoA基因中的優勢片段TRFs 155 bp 是屬分類水平中的Nitrosospira，即 AOB-amoA基因中的優勢菌屬為Nitrosospira，與土壤生態系統中氨氧化細菌 (AOB) 群落結構組成以Nitrosospira為主的研究結果[47]相一致。

總之，種植覆蓋作物后較多的植物根量和凋落物進入到土壤，它們的輸入和分解促進土壤有機質的形成和積累，增加土壤養分含量，改變土壤微生物的生長環境和食物來源，影響土壤微生物的繁殖能力[48]。覆蓋作物根系分泌物為土壤微生物提供碳源，不同的覆蓋作物分泌不同的物質，為土壤微生物種類及數量的增加提供了基礎[49]。豆禾混播促進了土壤微生物的生長，且微生物的生長又促進了土壤有機物的礦化、礦質營養含量的提高，進而形成覆蓋作物與微生物、礦質營養在土壤中的相互依存相互促進的關系[37]。

綜上所述，本研究以連續種植不同覆蓋作物的獼猴桃果園為研究對象，探討了獼猴桃園覆蓋作物種植對土壤氨氧化微生物豐度、群落結構以及土壤生態系統的影響，結果表明兩種混種模式顯著改變了獼猴桃園土壤理化性質，從而改變土壤氨氧化微生物豐度和群落結構，影響了氮循環過程中的氨氧化作用，進而影響了整個氮循環。本研究探討了果園種植不同覆蓋作物對土壤氨氧化微生物豐度和群落結構的影響機制，為理解覆蓋作物種植對土壤氨氧化微生物群落結構和土壤生態系統的影響提供了理論依據。本研究采用的土壤氨氧化微生物分析方法為熒光定量 PCR (fluorescence quantitative PCR)、末端限制性片段長度多態性 (terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP) 以及克隆測序技術，但是只能分析土壤氨氧化微生物部分種群，需要采用更為先進的土壤微生物分析方法，如高通量測序、同位素示蹤技術等，對土壤氨氧化微生物全體進行研究；且本研究僅為2年，不同年限的覆蓋作物種植會引起不同的環境變化，進而可能對研究結果產生影響，因此要深入研究覆蓋作物種植對土壤氨氧化微生物的影響機制，還需要做長期的監測研究。

4 結論

1) 與清耕相比，覆蓋作物種植對氨氧化微生物(AOA-amoA和AOB-amoA) 基因豐度有顯著性影響，白三葉草單種可顯著提高AOA-amoA基因豐度，白三葉草單種或者白三葉草和黑麥草混種可以顯著提高AOB-amoA基因豐度。

2) 不同 T-RFs 所代表的 AOA 在不同種植模式中所占比例發生變化，但AOA群落結構未發生明顯改變，不同T-RFs所代表的AOB在不同種植模式下發生變化，其氨氧化細菌 (AOB) 群落結構可能發生改變。覆蓋作物處理對土壤AOA多樣性指數、均勻度指數以及AOB多樣性指數均有顯著影響。

3) 覆蓋作物種類對氨氧化微生物群落組成沒有顯著性影響，各覆蓋作物處理的獼猴桃園土壤氨氧化古菌 (AOA) 均為Nitrososphaera和Nitrosotalea，氨氧化細菌 (AOB) 均為Nitrosospira和Nitrosomonas。

4) 影響氨氧化微生物群落結構變化的主要因素是土壤pH、含水率、銨態氮和硝態氮含量。白三葉草和黑麥草混合種植顯著提高了土壤含水率、銨態氮和硝態氮含量，降低了土壤pH，白三葉草單種顯著提高了土壤硝化潛勢。