基于宏基因組學(xué)方法分析施肥模式對設(shè)施菜田土壤微生物群落的影響

馬 龍，高 偉，欒好安，唐繼偉*，李明悅，黃紹文*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室，北京 100081；2 天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，天津 300192；3 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，保定 071000）

目前，我國蔬菜體系分為設(shè)施蔬菜和露地蔬菜兩種，設(shè)施蔬菜因其高投入、高產(chǎn)出、高收益的生產(chǎn)特點得到迅速發(fā)展，已成為許多地區(qū)的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)。2016年設(shè)施蔬菜播種面積達(dá)386.7萬hm2，占蔬菜總播種面積的18%左右，但產(chǎn)量占蔬菜總產(chǎn)量約34%，產(chǎn)值占蔬菜總產(chǎn)值的一半左右[1-3]。然而，設(shè)施蔬菜栽培過程中普遍存在化肥投入過量、養(yǎng)分比例嚴(yán)重失衡、施肥模式不夠合理等現(xiàn)象，導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)含量下降、養(yǎng)分過度積累、微生物群落結(jié)構(gòu)破壞等問題，嚴(yán)重制約我國設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4-5]。針對上述問題，在合理施肥條件下使用有機(jī)肥/有機(jī)物料替代部分化肥可以使設(shè)施蔬菜的化肥減施潛力達(dá)到35%以上[6]。

土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有種類多、數(shù)量大等特點，主要包括細(xì)菌、真菌和古菌，其通過自身生長代謝參與有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分的分解與轉(zhuǎn)化，為土壤養(yǎng)分循環(huán)和能量流動提供動力和保障[7-8]。土壤生物學(xué)特性 (微生物量、群落結(jié)構(gòu)等) 可以反映土壤質(zhì)量及肥力狀況，被認(rèn)為是土壤環(huán)境質(zhì)量評價的重要指標(biāo)[9-10]。前人關(guān)于不同施肥模式下土壤微生物群落方面的研究多集中在細(xì)菌、真菌[11-13]，對土壤古菌的研究十分有限[14-16]。有研究表明，古菌在土壤碳、氮循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，能參與CH4代謝、氨氧化等過程，是土壤中的潛在養(yǎng)分庫[17]。土壤微生物易受外界環(huán)境變化的影響，施肥可直接或間接改變農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分平衡和供應(yīng)狀況，從而對土壤生物學(xué)特性產(chǎn)生影響[18]。有學(xué)者指出，盛果期作為果菜生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，對土壤養(yǎng)分的需求量較高，土壤微生物活動劇烈[19-20]。因此，明確不同施肥模式對設(shè)施果菜盛果期土壤生物學(xué)特性的影響，對于農(nóng)田土壤養(yǎng)分管理具有重要意義。

隨著土壤微生物相關(guān)研究的日益深入，研究方法也在不斷改進(jìn)。目前國內(nèi)外對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究方法和技術(shù)多集中在磷脂脂肪酸分析法[21-23]、定量PCR擴(kuò)增技術(shù)[24]和高通量測序 (16S RNA和ITS) 技術(shù)[25-26]，應(yīng)用宏基因組方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少。有學(xué)者指出，宏基因組測序技術(shù)可以跨過微生物分離和純培養(yǎng)過程，揭示土壤中全部存在的微生物遺傳組成和群落功能，建立土壤微生物物種與環(huán)境之間的關(guān)系[27-28]。另有研究發(fā)現(xiàn)，利用宏基因組測序可以同步進(jìn)行土壤細(xì)菌、真菌和古菌的測定，既可以分析土壤微生物的組成，也可以分析各物種的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而更深入地探明不同施肥模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。因此，有必要開展基于宏基因組分析不同施肥模式對設(shè)施菜田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究。

利用天津市西青區(qū)蔬菜基地日光溫室蔬菜不同施肥模式定位試驗，在調(diào)查不同施肥模式下土壤微生物量及豐度的基礎(chǔ)上，探究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性的變化，以此分析有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施菜田土壤生態(tài)環(huán)境的影響，為設(shè)施菜田制定合理高效的施肥方案提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地點位于天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)第六埠村(117°0′E，39°13′N)，該區(qū)屬于暖溫帶半濕潤大陸性氣候，全年平均溫度11.6℃、自然降水量586 mm、無霜期203天、日照總量2810 h。供試日光溫室東西走向，長 80 m、寬 6.5 m (含 0.5 m 通道)，溫室前部有通風(fēng)口，白天適時敞開通風(fēng)，夜間或降雨時關(guān)閉。供試土壤類型為中壤質(zhì)潮土。定位試驗起始時間為2009年10月 (定位試驗開始時棚齡為7年)，種植制度為春茬番茄-秋冬茬芹菜輪作。定位試驗開始前0—20 cm土層基本理化性質(zhì)為：pH 7.9、有機(jī)質(zhì)25.4 g/kg、硝態(tài)氮 186.2 mg/kg、速效磷 144.6 mg/kg、速效鉀 404.0 mg/kg。供試芹菜 (Apium graveolens) 品種為‘文圖拉’，番茄 (Lycopersicon esculentum) 品種為‘朝研299’。

1.2 試驗設(shè)計

選取定位試驗6個處理，分別為：1) 全部使用化肥氮 (4/4CN)；2) 3/4 化肥氮+1/4 豬糞氮(3/4CN+1/4MN)；3) 2/4 化肥氮+2/4 豬糞氮(2/4CN+2/4MN)；4) 1/4 化肥氮+3/4 豬糞氮(1/4CN+3/4MN)；5) 2/4 化肥氮+1/4 豬糞氮+1/4 秸稈氮 (2/4CN+1/4MN+1/4SN)；6) 2/4 化肥氮+2/4 秸稈氮(2/4CN+2/4SN)。各處理等量氮磷鉀，番茄茬施用的N、P2O5和K2O總量分別為450、225和600 kg/hm2，芹菜茬施用的N、P2O5和K2O總量分別為450、300和600 kg/hm2。春茬番茄和秋冬茬芹菜各處理的具體氮和碳投入量見表1。試驗為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個處理 3 次重復(fù)，小區(qū)面積 14.4 m2(寬 2.4 m×長 6.0 m)。番茄株、行距分別為0.3 m和0.6 m，種植密度為25000株/hm2；芹菜株、行距分別為0.20 m和0.15 m，種植密度為330570株/hm2。為防止小區(qū)間養(yǎng)分和水分的橫向遷移，小區(qū)間埋設(shè)厚度為4 mm PVC板(100 cm 埋于地下、5 cm 露出地面)。

表 1 春茬番茄和秋冬茬芹菜各施肥處理中氮、碳投入量 (kg/hm2)Table 1 Nitrogen and carbon inputs in fertilization treatments during spring tomato and autumn-winter celery season

有機(jī)肥全部基施，化肥部分基施，部分作追肥施用。番茄季處理1～6所用化肥中20%氮肥、70%磷肥和20%鉀肥基施，剩余氮肥和鉀肥分4次追施 (分別在番茄開花期、第一穗果膨大期、第二穗果膨大期和第三穗果膨大期)，氮肥追施比例分別為30%、30%、10%和10%，鉀肥追施比例分別為10%、30%、30%和10%，剩余磷肥在第一次和第二次追肥各施入15%。芹菜季處理1～6所用化肥中20%氮肥、70%磷肥和20%鉀肥基施，剩余氮肥和鉀肥在芹菜5～6葉期、8～9葉期和11～12葉期分3次追施，氮肥追施比例分別為35%、35%和10%，鉀肥追施比例分別為10%、35%和35%，剩余磷肥在第一次追肥時全部施入。

定位試驗所施用的化肥為尿素 (N 46%)、過磷酸鈣 (P2O512%)、磷酸二銨 (N 18%、P2O546%)、氯化鉀 (K2O 60%) 和磷酸二氫鉀 (P2O552%、K2O 34%)。所用有機(jī)肥 (商品豬糞) N、P2O5、K2O和C含量分別為 21.7、13.9、16.3和218 g/kg (干基)，水分含量為28.9%；所用玉米秸稈N、P2O5、K2O和C含量分別為 10.4、3.2、16.9和427 g/kg (干基)，水分含量為64.9%。

基施方式為肥料撒施后旋耕入地，追肥方式為肥料溶于水后隨水沖施。各處理均是依據(jù)田間持水量進(jìn)行灌溉，當(dāng)田間持水量低于60%時進(jìn)行灌溉。為保證灌水量的準(zhǔn)確，每個小區(qū)均安裝有單獨(dú)的PVC進(jìn)水管，并用水表記錄灌水量。番茄季和芹菜季灌水總量分別為3889和3334 m3/hm2。

1.3 土壤樣品采集及測定方法

1.3.1 土壤樣品采集 2019年5月23日于定位試驗第20茬設(shè)施蔬菜 (春茬番茄盛果期，番茄定植后80天) 采集土壤樣品。土壤樣品的采集方法是在每個小區(qū)內(nèi)按“S”形布設(shè)10個點，采取0—20 cm土壤樣品，剔除石礫、植物殘根等雜物，混勻裝袋，過2 mm篩備用。用四分法取10 g左右的鮮土送去測序公司，進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu) (宏基因組) 分析測定；取一部分放4℃冰箱內(nèi)保存，用于微生物量碳與氮含量的測定；剩余土壤樣品風(fēng)干后，過1 mm篩和0.15 mm篩用于測定土壤基礎(chǔ)理化指標(biāo)。

1.3.2 土壤微生物群落宏基因組測定 使用美國Omega Bio-Tek 公司的 E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.) 試劑盒提取土壤中微生物總DNA。完成基因組DNA提取后，利用TBS-380檢測DNA濃度，采用NanoDrop200檢測DNA純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。通過Covaris M220將DNA片段化，篩選約 300 bp 的片段，利用 TruSeq? DNA Sample Prep Kit試劑盒構(gòu)建PE文庫；采用HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit試劑進(jìn)行橋式PCR分析；使用HiSeq 3000/4000 SBS Kits試劑進(jìn)行 lluminaHiseq 測序。

使用MetaGene軟件對拼接結(jié)果中的contigs進(jìn)行ORF預(yù)測。選擇核酸長度大于等于100 bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列；用CD-HIT軟件對所有樣品預(yù)測出來的基因序列進(jìn)行聚類，每類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集；使用SOAPaligner軟件，分別將每個樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對，統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息[29]。使用BLASTP將非冗余基因集序列與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并通過NR庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋，然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計算該物種的豐度[30]。

1.3.3 土壤微生物量碳氮測定及計算公式 土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸—硫酸鉀浸提，通過碳氮分析儀 (Multi N/C 3100) 測定。

土壤微生物量碳BC(mg/kg)=EC/kEC

土壤微生物量氮BN(mg/kg)=EN/kEN

式中：EC、EN為熏蒸土與未熏蒸土壤碳/氮的差值；kEc為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.38；kEN為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值0.45[31]。

1.3.4 土壤微生物群落Shannon指數(shù)和Ace指數(shù)計算[32]

式中：Sobs=實際觀測到的物種數(shù)目；ni—第i個物種所含的序列數(shù)；N—所有的序列數(shù)。

2) Ace 豐富度指數(shù)：

式中，ni—含有i條序列的物種數(shù)目；Srare—含有“abund”條序列或者少于“abund”的物種數(shù)目；Sabund—多于“abund”條序列的物種數(shù)目；abund—“優(yōu)勢”物種的閾值，默認(rèn)為10。

1.3.5 土壤基礎(chǔ)理化指標(biāo)測定 土壤硝態(tài)氮采用2 mol/L 氯化鉀溶液浸提，雙波長 (210 nm和270 nm)紫外分光光度法測定；土壤速效磷采用0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀采用1 mol/L醋酸銨浸提，原子吸收分光光度計測定；土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀–濃硫酸氧化 (外加熱)法測定；土壤pH采用2.5∶1水土比，酸度計測定[33]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 16.0 (SPSS Inc.Chicago，IL) 單因素 ANOVA 方差分析及多重比較 (Duncan)，運(yùn)用R語言統(tǒng)計軟件進(jìn)行土壤微生物群落Shannon指數(shù)和Ace指數(shù)計算、主成分分析 (PCA) 和冗余分析 (RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物量碳、氮含量的影響

由表2可以看出，隨有機(jī)肥用量的增加，土壤微生物量碳 (MBC) 和微生物量氮 (MBN) 含量均呈增加趨勢。配施高量有機(jī)肥模式 (1/4CN+3/4MN) 土壤MBC和MBN含量均顯著高于配施低量、中量有機(jī)肥模式 (3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN)，增幅分別為20.9%～24.9%和57.1%～119.0%；配施秸稈模式(2/4CN+1/4MN+1/4SN、2/4CN+2/4SN) 均高于配施有機(jī)肥模式，增幅分別為31.9%～82.0%和14.7%～170.8%。

表 2 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理下土壤微生物量碳和氮含量 (mg/kg)Table 2 The soil microbial biomass carbon and nitrogen contents under different substitution proportions of organic materials

有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理的土壤MBC和MBN含量分別在185.2～337.0和13.7～37.1 mg/kg，平均分別為250.0和26.9 mg/kg，較單施化肥模式(4/4CN) 平均分別增加101.5%和134.6%，配施秸稈處理 (2/4CN+1/4MN+1/4SN、2/4CN+2/4SN) MBC 和MBN含量的增幅分別高達(dá)158.8%和210.9%。

2.2 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物豐度 表3顯示，有機(jī)肥/秸稈替代部分化肥處理可增加土壤細(xì)菌和真菌豐度，降低土壤古菌豐度。有機(jī)肥/秸稈替代處理的土壤細(xì)菌、真菌、古菌豐度分別在 1295.4×104～1485.8×104、93.0×102～110.4×102、20.9×104～26.6×104，平均分別為 1393.4×104、99.9×102、23.4×104，細(xì)菌和真菌豐度較4/4CN處理平均增加了8.6%、11.6%，而古菌豐度平均減少了21.7%。

表 3 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理下土壤微生物豐度 (Reads)Table 3 Soil microbial abundance under different substitution proportions of organic materials

高碳有機(jī)替代模式 (1/4CN+3/4MN、2/4CN+1/4MN+1/4SN、2/4CN+2/4SN) 土壤細(xì)菌和真菌豐度均高于低碳有機(jī)替代模式 (3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN)，而土壤古菌豐度均低于低碳有機(jī)替代模式。與低碳有機(jī)替代模式相比，高碳有機(jī)替代模式土壤細(xì)菌和真菌豐度增幅分別為8.1%～14.7%和6.8%～18.7%，平均分別增加12.3%和12.0%；土壤古菌豐度降幅為6.0%～21.4%，平均降低12.9%。

2.2.2 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物群落組成 從圖1可以看到，不同處理細(xì)菌的優(yōu)勢門組成相同，但是各菌門所占比例受到處理的影響。6個處理中相對豐度大于1%的土壤細(xì)菌優(yōu)勢門均有11個，以變形菌門 (Proteobacteria)相對豐度最大 (41.8%～48.4%)，其次是放線菌門(Actinobacteria，10.7%～12.7%)，再次是綠彎菌門(Chloroflexi，6.1%～8.6%)、酸桿菌門 (Acidobacteria，6.4%～7.0%)，相對豐度小于5%的土壤微生物優(yōu)勢門分別是芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes，4.5%～5.9%)、浮霉菌門 (Planctomycetes，3.8%～4.5%)、擬桿菌門 (Bacteroidetes，3.1%～3.7%)、厚壁菌門(Firmicutes，2.5%～2.8%)、藍(lán)藻細(xì)菌門 (Cyanobacteria，2.5%～2.9%)、疣微菌門 (Verrucomicrobia，2.1%～2.5%) 和硝化螺旋菌門 (Nitrospirae，1.3%～1.6%)。

圖 1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤細(xì)菌的群落組成 (門水平，相對豐度 > 1%)Fig.1 Soil bacteria community composition under different substitution proportion of organic materials(phylum level, relative abundance > 1%)

有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理提高了變形菌門相對豐度，降低放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度，其他菌門對不同施肥模式的響應(yīng)不敏感。與4/4CN相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤變形菌門的相對豐度增幅為8.7%～15.8%，平均增加11.1%；土壤放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度降幅分別為4.0%～15.4%、11.4%～29.1%、1.0%～24.6%、2.9%～12.5%和2.5%～16.9%，平均分別降低10.6%、19.6%、11.7%、8.6%和9.9%。

配施高量有機(jī)肥模式 (1/4CN+3/4MN) 土壤變形菌門、放線菌門和酸桿菌門的相對豐度均高于配施低量、中量有機(jī)肥模式 (3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN)，增幅分別為3.2%～5.9%、6.0%～6.1%和1.2%～5.3%，平均分別增加4.5%、6.1%和3.2%，而土壤綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻細(xì)菌門、疣微菌門和硝化螺旋菌門相對豐度均低于低量、中量有機(jī)肥模式，降幅分別9.1%～19.9%、9.1%～14.4%、4.0%～5.0%、1.6%～7.2%、1.6%～2.0%、3.6%～4.8%、9.6%～15.3%和13.5%～17.3%，平均分別降低14.5%、11.7%、4.5%、4.4%、1.8%、4.2%、12.4%和15.4%。

配施秸稈處理 (2/4CN+1/4MN+1/4SN、2/4CN+2/4SN) 土壤放線菌門、浮霉菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻細(xì)菌門的相對豐度均高于配施有機(jī)肥處理 (3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN、1/4CN+3/4MN)，增幅分別為2.7%～13.6%、5.0%～17.8%、4.0%～10.2%和3.8%～16.9%，平均分別增加9.1%、10.8%、6.9%和9.8%，而土壤酸桿菌門的相對豐度低于配施有機(jī)肥模式，降幅為2.3%～8.0%，平均降低5.7%。

由圖2可看出，不同施肥模式中相對豐度大于1%的土壤真菌優(yōu)勢門共有4個，其中以子囊菌門(Ascomycota) 相對豐度最大 (62.8%～65.4%)，其次為擔(dān)子菌門 (Basidiomycota，22.9%～25.2%)，相對豐度小于5%的土壤優(yōu)勢菌門分別為壺菌門(Chytridiomycota，3.8%～4.4%) 和球囊菌門(Glomeromycota，1.4%～1.9%)。

圖 2 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤真菌的群落組成 (門水平，相對豐度 > 1%)Fig.2 Soil fungi community composition under different substitution proportion of organic materials(phylum level, relative abundance > 1%)

有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式提高子囊菌門、壺菌門和球囊菌門相對豐度，降低擔(dān)子菌門的相對豐度。與4/4CN相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤子囊菌門、壺菌門和球囊菌門的相對豐度增幅分別為0.8%～3.7%、2.4%～7.6%和0.1%～30.3%，平均分別增加2.0%、5.1%和12.6%；擔(dān)子菌門的相對豐度降幅為1.9%～9.2%，平均降低4.6%。

1/4CN+3/4MN處理土壤壺菌門的相對豐度低于3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN處理，降幅為8.6%～9.9%，平均降低9.2%。

配施秸稈模式土壤壺菌門的相對豐度高于配施有機(jī)肥模式，增幅為2.6%～14.8%，平均增加7.3%，而土壤子囊菌門的相對豐度低于配施有機(jī)肥模式，降幅為0.1%～4.0%，平均降低2.2%。

圖3顯示，不同施肥模式下群落相對豐度大于1%的土壤古菌優(yōu)勢門共有4個，以奇古菌門(Thaumarchaeota)的相對豐度最大 (54.9%～65.1%)，其次為廣古菌門 (Euryarchaeota，26.1%～34.5%)，相對豐度小于5%的優(yōu)勢菌門分別為深古菌門 (Candidatus Bathyarchaeota，2.7%～3.6%) 和泉古菌門(Crenarchaeota，2.1%～2.8%)

圖 3 有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理下土壤的古菌群落組成 (門水平，相對豐度 > 1%)Fig.3 Soil archaea community composition under different substitution proportion of organic materials(phylum level, relative abundance > 1%)

有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式提高土壤廣古菌門和深古菌門相對豐度，降低奇古菌門的相對豐度，對泉古菌門影響不明顯。與4/4CN相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤廣古菌門和深古菌門的相對豐度增幅分別為5.8%～31.9%和1.1%～25.3%，平均分別增加21.7%和16.0%；奇古菌門的相對豐度降幅為2.2%～15.6%，平均降低10.5%。

1/4CN+3/4MN處理土壤廣古菌門、深古菌門和泉古菌門的相對豐度均高于3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN處理，增幅分別為7.1%～22.6%、12.7%～24.5%和2.8%～15.5%，平均分別增加10.9%、14.8%和9.1%，而土壤奇古菌門的相對豐度低于配施低量、中量有機(jī)肥模式，降幅為9.1%～12.8%，平均降低10.9%。

配施秸稈模式土壤泉古菌門的相對豐度高于配施有機(jī)肥模式，增幅為6.4%～32.1%，平均增加21.1%.

2.3 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物群落Alpha多樣性

微生物多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)功能和環(huán)境穩(wěn)定性密切相關(guān)，較高的微生物多樣性是抵御外界環(huán)境干擾的重要保障[34-35]。表4顯示，有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理的土壤細(xì)菌、真菌和古菌的Shannon指數(shù)分別在6.94～7.03、5.29～5.33和3.86～4.24，平均分別為6.99、5.31和4.09，較4/4CN處理平均分別增加0.7%、1.4%和9.0%，其中高碳有機(jī)替代模式土壤細(xì)菌、真菌和古菌Shannon指數(shù)平均分別增加1.0%、1.7%和11.9%。

表 4 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理下土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 4 Soil microbial diversity index as affected by partial substitution of chemical fertilizer by organic materials

有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤細(xì)菌和真菌的Ace指數(shù)均高于單施化肥模式，其中高碳有機(jī)替代模式效果較好。有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式土壤細(xì)菌和真菌Ace指數(shù)分別在11968.0～12042.0和374.3～388.0，平均分別為11997.0和381.5，較單施化肥模式平均分別增加1.3%和3.1%。

2/4CN+1/4MN+1/4SN模式土壤細(xì)菌、真菌和古菌Shannon和Ace指數(shù)在不同施肥模式中均呈較高的水平，說明此模式下土壤生態(tài)系統(tǒng)更為穩(wěn)定，抵御外界環(huán)境變化的能力更強(qiáng)。

2.4 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的主成分分析及冗余分析

對18個樣品的土壤細(xì)菌、真菌和古菌在種(species) 水平上進(jìn)行主成分分析 (圖4)，可以看出第一軸的解釋量分別為27.3%、24.1%和17.8%，第二軸的解釋量分別為9.6%、15.0%和9.6%。單施化肥與有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理的土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)可分為彼此之間界限明確的兩組，古菌群落結(jié)構(gòu)按不同施肥模式則可分為4組：4/4CN、3/4CN+1/4MN、2/4CN+2/4MN和2/4CN+1/4MN+1/4SN、1/4CN+3/4MN和2/4CN+2/4SN。表明不同施肥模式對土壤古菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響強(qiáng)于對細(xì)菌和真菌。

圖 4 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig.4 Principal component analysis (PCA) of soil microbial community structure under different substitution proportion of organic materials

經(jīng)過10年20季種植后，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式較單施化肥模式提高了土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮和速效磷含量，增幅分別為24.0%～67.1%、10.8%～76.9%和17.9%～113.1%，對pH和速效鉀含量影響不顯著 (表 5)。

表 5 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式下土壤理化性質(zhì)Table 5 Soil physicochemical properties under partial substitution of chemical fertilizer by organic amendments

土壤理化性質(zhì)對土壤細(xì)菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)影響的冗余分析 (RDA) 結(jié)果顯示，在分析的5個指標(biāo)中，有機(jī)碳 (P=0.001)、pH (P=0.006) 和硝態(tài)氮 (P=0.002) 對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，分別解釋其群落結(jié)構(gòu)變異的22.3%、20.3%和16.1%；有機(jī)碳 (P=0.001) 和硝態(tài)氮 (P=0.001) 對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，分別解釋其群落結(jié)構(gòu)變異的10.4%和8.9%；硝態(tài)氮 (P=0.001) 和有機(jī)碳 (P=0.001) 對土壤古菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，分別解釋其群落結(jié)構(gòu)變異的36.0%和34.7% (圖5)。因此，土壤有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量是影響細(xì)菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)的共同因素。

圖 5 不同有機(jī)肥/秸稈替代化肥處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性狀關(guān)系的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis (RDA) of soil microbial community structure constrained by soil physicochemical properties in each organic substitution treatment

3 討論

3.1 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物豐度的影響

有機(jī)肥長期替代部分化肥對土壤中不同微生物群體的結(jié)構(gòu)和豐度影響不同。在黑土小麥–大豆–玉米輪作體系下，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施能夠增加細(xì)菌豐度，降低真菌豐度[36]，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施模式顯著提高砂姜黑土細(xì)菌和真菌豐度[37]。丁建莉等[38]對東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施模式土壤真菌豐度顯著低于單施化肥模式。長期單獨(dú)施用化肥會導(dǎo)致土壤板結(jié)、酸化，抑制微生物的生長[39]，而有機(jī)肥、有機(jī)物料的投入可改善土壤結(jié)構(gòu)及其養(yǎng)分狀況，為微生物生長、繁殖提供充足的“食物”及較佳的“微環(huán)境”[40]，較高的有機(jī)替代模式可為微生物生長繁殖提供更多樣、更豐富的能源物質(zhì)。在本試驗中，高碳有機(jī)替代處理較單施化肥顯著提高了設(shè)施蔬菜土壤中的細(xì)菌、真菌豐度，但是降低了古菌的豐度。

與土壤細(xì)菌相比古菌數(shù)量很低，但對土壤的碳氮代謝起著至關(guān)重要的作用[17]，因而成為土壤微生物研究的一個重要內(nèi)容。袁紅朝等[41]對稻田土壤的研究表明，化肥配施秸稈相較于單施化肥可顯著提高土壤古菌豐度。邢亞薇等[42]也證明與單施化肥模式相比，有機(jī)肥與無機(jī)肥配施增加黑壚土土壤古菌豐度。而在本研究中，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式卻降低了土壤中的古菌豐度。有學(xué)者指出，土壤微生物群落亞群間存在著一定的競爭關(guān)系，某一亞群的快速生長必然會因競爭“食物”等資源，對其他亞群的生長產(chǎn)生一定的抑制作用[43]。有研究表明，細(xì)菌、真菌對養(yǎng)分的競爭能力要強(qiáng)于古菌[44]，本研究有機(jī)肥/秸稈的投入對土壤真菌及細(xì)菌的促進(jìn)作用，可能增強(qiáng)了其對碳、氮的競爭，抑制了土壤古菌的數(shù)量。

3.2 有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施春茬番茄盛果期土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

從本試驗的結(jié)果可知，設(shè)施蔬菜土壤細(xì)菌的主要優(yōu)勢菌群包括變形菌門 (41.8%～48.4%)、放線菌門 (10.7%～12.7%)、綠彎菌門 (6.1%～8.6%) 和酸桿菌門 (6.4%～7.0%)。與單施化肥相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥可提高變形菌門相對豐度，降低放線菌門和綠彎菌門相對豐度；與只配施糞肥模式相比，同時配施秸稈可提高放線菌門的相對豐度，降低酸桿菌門的相對豐度。劉平靜等[11]的研究表明，有機(jī)無機(jī)肥配施顯著降低了土放線菌門的相對豐度；孫瑞波等[45]的研究表明，秸稈與化肥配施會提高砂姜黑土變形菌門和酸桿菌門相對豐度，顯著降低放線菌門的相對豐度。變形菌門被認(rèn)為是富營養(yǎng)菌群，可在營養(yǎng)豐富的土壤環(huán)境中迅速繁殖，而放線菌門和綠彎菌門作為土壤中耐脅迫能力較強(qiáng)的微生物，對不利環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，適宜在養(yǎng)分較低的環(huán)境中繁殖[46-48]。本研究中，有機(jī)肥/秸稈的投入可提高土壤有機(jī)碳、硝態(tài)氮及速效磷的含量，更適合富營養(yǎng)菌群 (變形菌門) 的生長，相對來講，單施化肥更利于耐脅迫菌群(放線菌門、綠彎菌門) 的生長繁殖。

在本研究中，設(shè)施蔬菜土壤真菌的主要優(yōu)勢菌群包括子囊菌門 (62.8%～65.4%)、擔(dān)子菌門(22.9%～25.2%)、壺菌門 (3.8%～4.4%) 和球囊菌門(1.4%～1.9%)。與單施化肥相比，有機(jī)肥/秸稈替代部分化肥提高了子囊菌門、壺菌門和球囊菌門相對豐度，降低擔(dān)子菌門的相對豐度，配施有機(jī)肥模式土壤子囊菌門的相對豐度高于配施秸稈模式。子囊菌門具有分解土壤易降解有機(jī)底物的能力，且其比擔(dān)子菌門具有更高的物種進(jìn)化速度和多樣性[49-50]。由于有機(jī)肥比秸稈更易被降解，子囊菌門對配施有機(jī)肥的環(huán)境喜好性更強(qiáng)，故在配施有機(jī)肥模式中子囊菌門相對豐度更高。

與細(xì)菌和真菌相比，學(xué)者對土壤古菌的了解非常有限，目前提出的27個古菌門只有6個有培養(yǎng)代表，隨著基因組測序和計算方法的發(fā)展正在加深對古菌的了解[14]。本試驗結(jié)果表明，奇古菌門 (54.9%～65.1%)、廣古菌門 (26.1%～34.5%)、深古菌門(2.7%～3.6%) 和泉古菌門 (2.1%～2.8%) 是土壤古菌主要優(yōu)勢菌群。土壤古菌被認(rèn)為存在于極端環(huán)境 (如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高鹽環(huán)境) 中，對生存環(huán)境或底物的要求苛刻，耐脅迫的能力強(qiáng)[51-52]，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式為土壤增加多種養(yǎng)分與能量，土壤古菌可更好地適應(yīng)土壤的變化，故土壤古菌對土壤環(huán)境的響應(yīng)會更強(qiáng)。在本研究中，與單施化肥模式相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式提高土壤廣古菌門和深古菌門的相對豐度，降低奇古菌門的相對豐度。王寧等[53]對稻田土壤古菌群落組成的研究也表明，奇古菌門(97.3%～98.1%) 為土壤古菌主要優(yōu)勢菌群，秸稈還田后，可大大降低土壤中奇古菌門相對豐度。有學(xué)者指出，奇古菌門在土壤氨氧化過程 (硝化作用的限速步驟) 中起著重要作用[54-55]。有機(jī)無機(jī)肥配施能有效地降低土壤硝酸鹽含量，并且施用高碳氮比的有機(jī)物料可促使土壤硝態(tài)氮更多地轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸锪康獌Υ鎇56]。本研究中奇古菌門豐度的降低從另一個角度證明了有機(jī)無機(jī)替代調(diào)節(jié)土壤中硝態(tài)氮含量的有益作用。

土壤微生物群落多樣性指數(shù)對不同施肥模式的響應(yīng)存在差異。有學(xué)者指出，長期有機(jī)肥和無機(jī)肥配施能提高土細(xì)菌的Shannon指數(shù)[9]，在稻田土壤化肥與秸稈配施可提高土壤細(xì)菌和古菌的Shannon指數(shù)[41]，與單施化肥相比，單施有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)肥配施均能提高黑土細(xì)菌和真菌的Shannon和豐富度指數(shù)[36]。另有研究表明，施用有機(jī)肥也會降低黃土真菌Shannon指數(shù)[13]。本試驗結(jié)果表明，與單施化肥模式相比，有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式提高土壤細(xì)菌、真菌和古菌Shannon指數(shù)及Ace指數(shù)，其中以2/4CN+1/4MN+1/4SN模式效果最佳。究其原因為：2/4CN+1/4MN+1/4SN模式為化肥–有機(jī)肥–秸稈配施，化肥可為土壤微生物生長繁殖提供大量速效養(yǎng)分，有機(jī)肥/秸稈二者的投入可為微生物提供更多的、更豐富的碳源底物，而且可改善由單施化肥引起的土壤酸化和養(yǎng)分不均衡的弊端，增加土壤微生物多樣性，提高抵御外界環(huán)境干擾的能力，使土壤生態(tài)系統(tǒng)功能趨于穩(wěn)定。

土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)直接影響土壤微生物的養(yǎng)分供給能力以及生存環(huán)境。趙鳳艷等[57]的研究表明，銨態(tài)氮、電導(dǎo)率、pH和全碳是影響土壤細(xì)菌群落變化的重要環(huán)境因子，丁建莉等[38]的研究表明有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要影響因子。還有研究表明，pH與C/N值是影響稻田土壤古菌群落結(jié)構(gòu)變化的重要影響因子[51]。依據(jù)本研究的主成分分析 (PCA) 結(jié)果，土壤細(xì)菌和真菌對不同施肥模式的響應(yīng)弱于土壤古菌；依據(jù)冗余分析(RDA) 結(jié)果，有機(jī)碳 (P=0.001)、硝態(tài)氮 (P=0.002)顯著影響土壤細(xì)菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)組成。硝態(tài)氮作為速效養(yǎng)分可被微生物直接利用參與土壤氮代謝過程，有機(jī)碳作為土壤碳源的外在反映，影響土壤微生物的活動[38]?？梢哉J(rèn)為，施肥模式通過影響土壤理化性狀，最主要的是有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量，影響了設(shè)施菜田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

綜合本試驗結(jié)果及10年定位試驗產(chǎn)量數(shù)據(jù)(2/4CN+1/4MN+1/4SN模式產(chǎn)量最高)[58]，表明化肥–有機(jī)肥–秸稈配施模式 (2/4CN+1/4MN+1/4SN) 為設(shè)施菜田可持續(xù)發(fā)展的模式。

4 結(jié)論

有機(jī)肥/秸稈替代化肥，特別是高碳有機(jī)替代模式可促進(jìn)土壤微生物生長繁殖，提高土壤微生物量碳含量、微生物量氮含量，提高細(xì)菌和真菌豐度，降低土壤古菌豐度。

有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式雖然沒有改變微生物的組成結(jié)構(gòu)，但是影響了優(yōu)勢菌群的比例。配施有機(jī)肥或秸稈可提高適宜于富養(yǎng)環(huán)境的細(xì)菌和真菌菌群，降低適應(yīng)惡劣營養(yǎng)環(huán)境的菌群數(shù)量。驅(qū)動土壤細(xì)菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)改變的主要土壤環(huán)境因子為有機(jī)碳、硝態(tài)氮含量。設(shè)施蔬菜土壤較高的養(yǎng)分含量和環(huán)境，致使細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成對施肥模式的響應(yīng)弱于土壤古菌。設(shè)施蔬菜土壤古菌的主要優(yōu)勢菌群包括奇古菌門 (54.9%～65.1%)、廣古菌門 (26.1%～34.5%)、深古菌門 (2.7%～3.6%) 和泉古菌門 (2.1%～2.8%)。有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式提高土壤廣古菌門和深古菌門的相對豐度，降低奇古菌門的相對豐度。