β-環糊精/卵白蛋白復合抗凍劑對凍藏過程鲌魚品質的影響

呂美雯，熊舟翼，張仲李，熊漢國*

(1.華中農業大學 食品科學與技術學院，武漢 430070；2.武漢農業科學技術研究院農產品加工中心，武漢 430200)

鲌魚(Culteralburnus)是我國優質的淡水魚類，肉質細嫩、營養豐富，深受消費者的喜愛[1]。目前，我國普遍采用凍藏的方法來保存鲌魚，但是凍藏過程中脂肪的氧化和冰晶的形成會導致魚肉組織劣變和肌原纖維蛋白變性。為了延緩凍藏過程中魚類品質的劣變，常添加4%蔗糖+4%山梨糖醇作為抗凍劑來保護魚類品質，但這些傳統抗凍劑的加入會引起甜味和熱量增加，不符合現代消費者的健康需求。因此研究諸如低聚糖類、蛋白類等低甜度、低熱量抗凍劑的抗凍效果具有重要意義[2]。β-環糊精(β-CD)是由7個葡萄糖殘基構成的低聚糖，其分子中的羥基可以與蛋白質分子的官能團發生反應而抑制蛋白質聚集變性，從而起到食品保鮮的作用[3-4]。Liu等[5]、Walayat等[6]分別研究發現β-CD、OVA作為抗凍劑添加到肌原纖維蛋白中提高了其在凍藏過程中的穩定性，改善了凍藏過程中肌原纖維蛋白的功能特性。卵白蛋白(OVA)是蛋清蛋白(EWP)的主要成分，具有抗氧化、凝膠化等功能特性。已有研究報道OVA與糖類通過靜電相互作用形成了穩定的可溶性復合物，同時復合物的抗凍效果與復合物的質量配比、濃度以及溶解性有關[7]。然而對于不同濃度的β-CD/OVA復合物應用到鲌魚凍藏的抗凍效果卻鮮有研究。因此，本研究以β-CD和OVA為抗凍劑原料，通過濁度、透射電子顯微鏡、粒徑、Zeta電位和差示掃描量熱儀(DSC)分析來確定兩者復合的最佳質量配比。同時通過分析凍藏過程中魚肉品質下降與肌原纖維蛋白變性的內在聯系，探究不同濃度的β-CD/OVA復合物對鲌魚凍藏期間的抗凍作用，為β-CD/OVA作為復合抗凍劑的應用前景提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鲌魚(Culteralburnus)：由湖北省武漢農科院水產研究所提供(規格：2000～2200 g/尾)；卵白蛋白(純度大于90%)：購于德國Sigma-Aldrich公司；β-環糊精、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、順丁烯二酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、三氯乙酸、氯化鈣、硫酸亞鐵、鉬酸銨、三磷酸腺苷二鈉(ATP)：購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XHF-DY均質機 寧波森茲生物技術有限公司；AG-22331型臺式離心機 德國艾本德有限公司；722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Zetasizer Nano-ZS90型粒徑電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；JEM-2010 型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；200PC差示掃描量熱儀 德國耐馳有限公司；MR-60 LF-NMR分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；J-1500圓二光譜儀 日本島津有限公司。

1.3 β-CD/OVA復合物配比的確定

1.3.1 復合物樣品的制備

將β-環糊精(β-CD)與卵白蛋白(OVA)粉末分別按照4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的質量比混合分組，然后溶于去離子水(4 ℃)中并保持混合溶液最終的質量分數為10%，將上述溶液真空凍藏干燥即可得到不同質量比例的β-CD/OVA固體粉末。

1.3.2 濁度測定

用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.8)分別稀釋各組β-CD/OVA至濃度為20 mg/mL，攪拌至充分混勻之后，測定上述各組溶液在600 nm處的吸光值，即為濁度。

1.3.3 透射電子顯微鏡(TEM)觀察

參考文獻[8]的方法，用去離子水(4 ℃)分別稀釋各組β-CD/OVA至濃度為0.01 mg/mL，然后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.4 粒徑測定

用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.8)分別稀釋各組β-CD/OVA至濃度為5 mg/mL。利用粒徑電位分析儀測定上述各組溶液的流體動力學半徑，每次循環掃描12次，每次測定之前樣品平衡120 s。

1.3.5 Zeta電位測定

用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.8)分別稀釋各組β-CD/OVA至濃度為5 mg/mL。利用粒徑電位分析儀測定上述各組溶液的Zeta電位。

1.3.6 差示掃描量熱(DSC)測定

稱取 6.5 mg樣品，壓片密封處理進行DSC測試，掃描范圍為20～100 ℃，升溫速率為 5 ℃/min。

1.4 鲌魚魚肉品質的測定

1.4.1 魚肉樣品的制備

將新鮮的鲌魚宰殺，剔骨并去除頭尾后用去離子水(4 ℃)洗凈魚肉，將魚肉切成長、寬、厚約為3 cm×1 cm×1 cm大小，然后用去離子水(4 ℃)稀釋上述確定的最佳配比β-CD/OVA組至溶液的質量分數為0%、2%、4%和6%。將魚肉浸泡在不同濃度的各組溶液(4 ℃)中60 min，最后將水分瀝干在-18 ℃凍藏90 d。

1.4.2 持水性測定

參考文獻[9]的方法，并做如下修改：轉速4000 r/min，4 ℃條件下離心8 min。

1.4.3 質子密度圖像觀察

參考文獻[10]的方法，并做如下修改：重復時間5000 ms，縱向弛豫時間0.2 ms，選擇自旋回波時間0.2 ms。

1.4.4 組織結構觀察

參考文獻[11]的方法。

1.5 肌原纖維蛋白理化指標的測定

1.5.1 肌原纖維蛋白的提取與含量測定

肌原纖維蛋白的提取參考文獻[12]的方法，然后將提取的肌原纖維蛋白分別與2%、4%和6%上述確定的最佳配比β-CD/OVA組的凍干粉末混勻(以蛋白質量為基準)，其中0% β-CD/OVA組作為空白組對照，將所有樣品在-18 ℃條件下凍藏90 d。取1 g肌原纖維蛋白樣品，用0.6 mol/L NaCl溶液(pH 7.0)稀釋至25 mL，采用雙縮脲法[13]測定提取的肌原纖維蛋白含量，即為鹽溶性蛋白含量。

1.5.2 Ca2+-ATPase活性測定

參考文獻[14]的方法，并做如下修改：用0.6 mol/L NaCl溶液(pH 7.0)稀釋肌原纖維蛋白至5 mg/mL。

1.5.3 二級結構含量測定

參考文獻[15]的方法，并做如下修改：肌原纖維蛋白樣品濃度調整為1 mg/mL。

1.6 數據分析

所有試驗數據使用Origin 2019軟件作圖，用SPSS 22.0軟件進行方差和顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 β-CD/OVA復合物的濁度分析

β-CD/OVA復合溶液濁度值的變化反映了溶液狀態下粒子的溶解分散程度。不同質量比例β-CD/OVA的濁度變化見圖1。

圖1 不同質量配比對β-CD/OVA濁度的影響Fig.1 Effect of different mass ratios on turbidity of β-CD/OVA

由圖1可知，隨著OVA比例的增加，體系的濁度先顯著下降(P<0.05)后又逐漸增加，同時觀察到在組別1∶3中，復合體系的濁度值最小，表明在該比例下溶液中的粒子溶解性最好，相對其他組分散程度最好。

2.2 β-CD/OVA復合物的透射電鏡分析

不同質量比例β-CD/OVA的透射電子顯微鏡變化見圖2。

圖2 不同質量配比對β-CD/OVA TEM的影響Fig.2 Effect of different mass ratios on TEM of β-CD/OVA

由圖2可知，組別為4∶1、3∶1和2∶1的溶液中呈現出較多的聚合態粒子，此時體系中的復合物溶解分散程度較差。但隨著OVA比例的增加，溶液中粒子間的聚集程度明顯下降，復合物能夠均勻地溶解分散在溶液中。尤其是在組別1∶3中沒有觀察到明顯的粒子聚集，呈現較為均勻的分布狀態，結果與濁度分析結果一致。

2.3 β-CD/OVA復合物的粒徑分析

不同質量比例β-CD/OVA的粒徑變化見圖3。

圖3 不同質量配比對β-CD/OVA粒徑的影響Fig.3 Effect of different mass ratios on particle size of β-CD/OVA

由圖3可知，隨著OVA比例的增加，體系的粒徑先顯著下降(P<0.05)后又增加。在組別4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4中粒徑分別為660，562，309，271，121，114 nm，但在組別1∶3中觀察到體系的粒徑只有91 nm，顯著小于其他組別(P<0.05)，這可能是由于其他組別的溶液中形成了較大的聚集體，而組別1∶3中形成了小粒徑的可溶性復合物，這與透射電鏡的觀察結果一致，結果表明在組別1∶3的溶液中復合物粒子分布均勻且沒有形成聚集。

2.4 β-CD/OVA復合物的Zeta電位分析

β-CD/OVA復合物之間的相互作用力主要是靜電相互作用力。不同質量比例β-CD/OVA的Zeta電位變化見圖4。

圖4 不同質量配比對β-CD/OVA Zeta電位的影響Fig.4 Effect of different mass ratios on Zeta potential of β-CD/OVA

由圖4可知，隨著OVA比例的增加，電位絕對值先增加后減小，這可能是因為當OVA的比例增加時，OVA帶有的負電荷增加了體系的電位絕對值。在組別1∶3中觀察到體系的電位絕對值最大(P<0.05)，以上結果表明當β-CD與OVA的質量比為1∶3時，β-CD/OVA復合物之間具有較強的靜電排斥作用，減少了聚集，同時分子熱運動所需克服的能量增大，此時β-CD/OVA復合溶液體系最穩定。

2.5 β-CD/OVA復合物的DSC分析

通過上述分析發現在組別1∶1、1∶2、1∶3和1∶4中β-CD/OVA復合體系的溶解分散程度較好，體系較其他組別相對更穩定。因此，對這4組進行DSC分析來進一步確定β-CD/OVA復合的最佳配比。不同質量比例β-CD/OVA的DSC變化見圖5。差示掃描量熱圖中峰向上代表的是吸熱峰，反映的是蛋白質變性的過程。峰頂點對應的溫度是β-CD/OVA復合體系的熱變性溫度。

圖5 不同質量配比對β-CD/OVA DSC的影響Fig.5 Effect of different mass ratios on DSC of β-CD/OVA

由圖5可知，組別1∶4、1∶3、1∶2和1∶1的熱變性溫度分別為61.6，62.7，58.5，61.9 ℃。分析發現組別1∶3比組別1∶4、1∶2和1∶1的熱變性溫度分別提高了1.1，4.2，0.8 ℃，結果表明組別1∶3中β-CD/OVA復合體系的熱穩定性最好，該比例下復合體系最穩定。綜合以上分析，組別1∶3的復合溶液中粒子溶解分散程度最好，利于魚肉的浸漬處理，并且該組的穩定性最強，適合長期的凍藏研究。因此，最終選擇組別1∶3即β-CD/OVA的質量比為1∶3作為最佳配比進行下一步的鲌魚抗凍研究。

2.6 復合抗凍劑對魚肉持水性的影響

不同濃度β-CD/OVA處理的魚肉在凍藏90 d內的持水性變化見圖6。

由圖6可知，隨著凍藏時間的延長，魚肉的持水性逐漸下降。特別是空白組(0%)和2% β-CD/OVA處理組的魚肉持水性顯著下降(P<0.05)，然而4%、6%的β-CD/OVA處理組明顯抑制了肌肉持水性的下降。經過90 d的凍藏后，2%、4%和6%的β-CD/OVA處理組分別較空白組(0%)的持水性提高了3.14%、3.97%和2.48%，說明β-CD/OVA的處理能保護魚肉的持水效果，抑制持水性的下降，并且6% β-CD/OVA 的處理對抑制魚肉持水性下降的效果最好。

圖6 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間魚肉持水性的影響Fig.6 Effect of different concentration of β-CD/OVA on water holding capacity of fish during frozen storage

2.7 復合抗凍劑對魚肉質子密度圖像的影響

不同濃度β-CD/OVA 處理的魚肉在凍藏90 d內的質子密度圖像變化見圖7。

圖7 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間魚肉二維質子密度圖像的影響Fig.7 Effect of different concentration of β-CD/OVA on proton density images of fish during frozen storage

由圖7可知，在凍藏第0天時，各組樣品均含有較多的深色亮點，說明新鮮狀態的魚肉含水量高，魚肉的保水能力好。隨著凍藏時間的延長，各組樣品的深色亮點逐漸消失，說明魚肉組織的保水性變差。在凍藏第30天時，空白組(0%)的MRI圖中深色亮點明顯減少，而經過β-CD/OVA處理的各組MRI圖中亮點明顯多于空白組(0%)。凍藏90 d后，各組樣品的保水力均顯著下降，但4%、6% β-CD/OVA處理的魚肉保水力仍高于空白組(0%)和2% β-CD/OVA處理組，這可能是由于β-CD/OVA分子中的羥基與水結合提高了魚肉的保水能力。結果表明，未經過β-CD/OVA處理的魚肉保水能力明顯下降，6% β-CD/OVA處理的魚肉保水效果最好，4% β-CD/OVA處理的魚肉保水效果次之。

2.8 復合抗凍劑對魚肉組織結構的影響

不同濃度β-CD/OVA處理的魚肉在凍藏90 d內的內部肌肉組織結構變化見圖8。

圖8 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間魚肉組織切片的影響Fig.8 Effect of different concentration of β-CD/OVA on tissue sections of fish during frozen storage

由圖8可知，在凍藏第0天時，新鮮的魚肉組織結構排列整齊，肌肉細胞之間的空隙較小且排列緊密，此時魚肉的保水性最好。在凍藏30 d后，魚肉的組織結構保持得比較完整，細胞組織間隙逐漸變得疏松，這可能是由于在凍藏過程中冰晶的形成和生長對細胞組織造成了擠壓，引起了肌纖維間隙的增大。在凍藏90 d后，從圖中可以明顯看出各組的細胞間隙顯著增大，但是6% β-CD/OVA處理組的細胞間隙明顯比空白組(0%)和2%、4% β-CD/OVA處理的間隙緊密。這可能是由于β-CD/OVA的處理減少了冰晶的形成，抑制了肌肉組織受損，保護了肌肉結構的完整。

2.9 復合抗凍劑對鹽溶性蛋白含量的影響

魚肉中肌肉蛋白的功能性質主要由鹽溶性蛋白肌原纖維蛋白體現，測定鹽溶性蛋白的含量可以反映凍藏過程中鲌魚功能特性的變化。不同濃度β-CD/OVA處理的鹽溶性蛋白含量在凍藏90 d內的含量變化見圖9。

由圖9可知，在第0天時，鹽溶性蛋白含量大約為75 mg/mL，隨著凍藏時間的延長，鹽溶性蛋白含量呈下降趨勢。在凍藏了90 d后，空白組(0%)的鹽溶性蛋白含量顯著下降(P<0.05)，同時空白組(0%)、2%、4%和6% β-CD/OVA處理組的鹽溶性蛋白含量比0 d分別下降了59.1%、56.1%、50.5%和47.0%，結果表明，經過β-CD/OVA的處理有效抑制了鹽溶性蛋白含量的下降，明顯降低了鹽溶性蛋白含量下降的程度和速度，β-CD/OVA對蛋白的功能性質有明顯的保護作用。

圖9 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間鹽溶性蛋白含量的影響Fig.9 Effect of different concentration of β-CD/OVA on salt-soluble protein content during frozen storage

2.10 復合抗凍劑對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

不同濃度β-CD/OVA處理的肌原纖維蛋白在凍藏90 d內的Ca2+-ATPase活性變化見圖10。

圖10 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.10 Effect of different concentration of β-CD/OVA on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins during frozen storage

由圖10可知，隨著凍藏時間的延長，各組肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性均發生顯著下降(P<0.05)。在凍藏90 d后，空白組(0%)的Ca2+-ATPase活性下降速度最快，同時空白組(0%)的Ca2+-ATPase活性顯著低于2%、4%和6%處理組的Ca2+-ATPase活性，這可能是由于β-CD/OVA的處理減少了蛋白的交聯聚集，保護了蛋白質的結構完整。結果表明，空白組(0%)的Ca2+-ATPase活性下降程度最大，肌原纖維蛋白的完整性遭到了破壞，同時說明β-CD/OVA的處理能一定程度地抑制肌原纖維蛋白的交聯聚集。

2.11 復配抗凍劑對肌原纖維蛋白二級結構的影響

不同濃度β-CD/OVA處理的肌原纖維蛋白在凍藏90 d內的二級結構變化見圖11。

圖11 不同濃度的β-CD/OVA對凍藏期間肌原纖維蛋白二級結構的影響Fig.11 Effect of different concentration of β-CD/OVA on secondary structure of myofibrillar proteins during frozen storage

由圖11可知，隨著凍藏時間的延長，α-螺旋的百分比顯著降低(P<0.05)，逐漸向β-折疊、β-轉角和無規卷曲轉化。在第0天時，各組樣品的α-螺旋含量均保持在30%左右。在凍藏90 d后，空白組(0%)、2%、4%和6% β-CD/OVA處理組的α-螺旋含量分別下降了59.0%、56.1%、55.5%和51.3%，這可能是由于凍藏過程破壞了α-螺旋結構的穩定性，導致α-螺旋向其他結構轉化。對比發現6% β-CD/OVA處理組的α-螺旋百分比下降的最少，說明6% β-CD/OVA的處理能更好地保護蛋白質的二級結構，保持α-螺旋結構的穩定性。

3 結論

鲌魚在凍藏過程中由于肌原纖維蛋白的變性與降解，導致緊密的肌肉組織結構被破壞，使得魚肉失去原有的彈性和保水力[16]。同時在凍藏過程中由于魚肉組織中冰晶的形成和生長，對其細胞結構造成了不可逆的損傷，最終引起凍藏品質下降[17]。β-CD/OVA復合抗凍劑的添加延緩了鲌魚品質的劣變，一定程度上提高了蛋白結構和魚肉組織結構的穩定性，這是由于β-CD/OVA復合物分子中的羥基與肌肉組織中的水分結合，減少了冰晶形成，從而阻止了蛋白質分子的聚集與變性[18]。Walayat等報道了β-CD與EWP復合抑制了肌原纖維蛋白分子之間的相互作用，減少了蛋白質的聚集變性，從而保持了蛋白結構的穩定，這與本研究的結論一致。研究結果顯示，6% β-CD/OVA處理抑制了α-螺旋向其他二級結構轉化，增強了肌原纖維蛋白二級結構的穩定性，同時經過6% β-CD/OVA的處理顯著抑制了肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性的下降，改善了疏松的組織結構，從而提高了魚肉的保水能力和持水性能。6% β-CD/OVA的抗凍效果優于其他濃度的原因可能是隨著復合物濃度的增加，抗氧化作用增強，抑制了鲌魚蛋白和脂肪的氧化，提高了鲌魚的凍藏品質[19]。綜合以上分析，6%濃度1∶3配比的β-CD/OVA有望作為一種有效的新型功能復合抗凍劑應用到魚類的凍藏中。