18種芳香植物精油抑菌活性的比較研究

陳悅，胡璇，于福來，王凱，謝小麗，袁媛，徐子琪

(1.海南大學 林學院，海口 570228；2.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/海南省熱帶藥用植物工程研究中心，海口 571101；3.廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院， 廣州 510006；4.山東第一醫科大學第一附屬醫院，濟南 250014)

芳香植物是指具有芳香氣味且可供提取植物精油的栽培植物和野生植物[1]。我國海南島自古以來就被稱為香島，相對于其他芳香藥用植物生產省份具有得天獨厚的環境和資源優勢，但海南島芳香植物的開發利用還不夠深入，其生物活性有待進一步的挖掘和探索。植物精油又稱揮發油或香精油，是以植物的花、葉、根莖、果實等為原料,以蒸餾、壓榨、溶劑萃取等方式提煉出來的芳香味油狀液體[2]。2020年年初，新型冠狀病毒疫情暴發引起全世界的高度關注，在疫情防控過程中，消毒抑菌劑成為必需品。但近年來抗生素的長期使用使得致病細菌耐藥性的問題日漸突出，尋求綠色、高效、安全且環保的植物抑菌原料已成為當前的研究熱點[3-4]，對芳香植物精油進行抑菌活性的研究，從中尋找具有良好抑菌活性的芳香植物精油，有利于食品、醫藥、化妝品等行業抑菌產品的創新和研發[5-7]。基于此，本實驗選擇了海南島18種常見芳香植物提取的精油，通過對5種需氧細菌進行體外抑菌效果的對比研究，初步篩選出較佳抑菌活性的芳香植物精油，為海南島芳香植物資源的進一步開發和利用提供了一定的理論依據和參考。

1 材料

1.1 儀器

XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新風醫療器械有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州廣源凈化科技有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；Sartarius CPA225D電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；DU-800紫外-可見光分光光度計 美國貝克曼公司。

1.2 藥材與試劑

18種芳香植物精油：均購自海南萬寧興隆南藥植物精油館，純度為100%，規格均為10 mL，于4 ℃儲存，其詳細信息見表1。鏈霉素S8290：購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇(分析純)：購自國藥集團化學試劑有限公司。

表1 18種芳香植物精油信息Table 1 The information of 18 aromatic plant essential oils

續 表

1.3 菌株與培養基

金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC 9372、大腸桿菌EscherichiacoliATCC 25922、銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 27853：由青島大學藥學院李剛老師贈送；肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeBNCC 102997：購自于北京北納創聯生物技術研究院。MHA培養基(Mueller-Hinton Agar)和MHB培養基(Mueller-Hinton Broth)：均購自于北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 供試菌懸液的制備

在無菌條件下，取甘油凍存的標準菌株金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌分別接種至MHB培養基中，37 ℃培養12 h后，于MHA培養基中劃線使其能形成單個菌落，將接種平板放置于37 ℃培養24 h后，挑取典型單個菌落接種至MHB培養基中，于37 ℃培養18～24 h后，用紫外分光光度計測定菌液濃度OD600為0.5～0.6之間，檢驗純度后用MHB培養基分別將各菌液稀釋成1×106CFU/mL的菌懸液備用。

2.2 供試藥液的制備

將18種芳香植物精油(見表1)用無水乙醇稀釋配制成質量濃度為500 mg/mL的樣品溶液，以溶劑無水乙醇為陰性對照，15 μg/mL的鏈霉素為陽性對照，實驗前所有藥液均用0.22 μm濾膜過濾除菌，置于4 ℃冰箱冷存備用。

2.3 抑菌圈測定

采用濾紙片瓊脂平板擴散法[8]，在無菌條件下，將已滅菌并冷卻至50 ℃左右的MHA培養基倒入無菌培養皿中，水平放置凝固后，用移液槍分別吸取各菌懸液200 μL于培養基平板上，均勻涂布后備用。用移液槍分別吸取2.2項下濃度的各藥液20 μL滴于無菌濾紙片(d=6 mm)上，充分吸收后，將其貼在已涂布的各菌液培養基平板上，并標記好各藥液的名稱，每個菌重復3次，置于37 ℃培養箱中培養24 h。培養結束后，觀察并記錄抑菌圈的有無以及直徑大小作為判斷敏感度高低的標準，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑大小，取其平均值作為測定結果。結果判定按美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》為標準：直徑>20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，<10 mm為低敏。

2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用微量二倍稀釋法[9]，在96孔板上進行，從A1開始為第1孔，從左到右，每個板上1～10孔為藥液，11，12孔分別為陰性和陽性對照，每個板只能加1種菌。首先用移液槍向每排1～12個孔各加入100 μL各菌懸液，再分別吸取2.2項下濃度的各精油樣品溶液100 μL至第一孔，依次對第1～10孔做梯度稀釋，使其精油濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95，0.98，0.48 mg/mL，11，12孔分別加入5 μL的無水乙醇溶液和3 μg/mL的鏈霉素溶液，充分混勻，每種細菌3個重復。最后將96孔板置于37 ℃培養24 h，培養結束后，比較檢測組與對照組渾濁度差異，以無細菌生長的最低濃度為MIC。

2.5 最低殺菌濃度(MBC)的測定

采用瓊脂培養基平板法，取MIC以上未見細菌生長的孔內混合液于MHA培養基中均勻涂布，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察有無細菌生長，以菌落數不超過5個的平板所對應孔中的最低濃度為該藥物的MBC。

3 結果

3.1 藥敏試驗

由表2可知，18種芳香植物精油對革蘭氏陰性和陽性菌具有不同抑制作用，其中月桂、羅勒、香茅和馬郁蘭精油對金黃色葡萄球菌表現為高度敏感，巖蘭草精油和廣藿香精油無抑菌圈出現，其余12種精油分別表現為9種低度敏感和3種中度敏感；巖蘭草精油和廣藿香精油對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均未檢測出抑菌圈，其余16種精油對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均表現為低度敏感和中度敏感；18種芳香植物精油對銅綠假單胞菌均具有一定的敏感反應，其中百里香精油和羅勒精油為高敏反應，其余精油分別表現為9種低度敏感和7種中度敏感；百里香、天竺葵、羅勒、依蘭、香茅和馬郁蘭6種精油對肺炎克雷伯氏菌表現為高度敏感，廣藿香精油無抑菌圈出現，其余11種精油分別表現為9種低敏和2種中敏反應。抑菌效果見圖1。其中羅勒精油對5種細菌表現出的藥敏作用最好，抑菌圈大小分別為金黃色葡萄球菌16.31 mm、枯草芽孢桿菌14.5 mm、大腸桿菌14.65 mm、銅綠假單胞菌16.76 mm、肺炎克雷伯氏菌17.09 mm；廣藿香精油和巖蘭草精油對5種細菌表現出的藥敏作用較差，其中廣藿香精油的敏感度最差，僅對銅綠假單胞菌具有作用，抑菌圈為8.10 mm。

表2 18種芳香植物精油對5種細菌的抑菌圈直徑Table 2 The inhibitory zone diameters of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

續 表

圖1 18種芳香植物精油對5種細菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria

3.2 MIC值測定結果

表3 18種芳香植物精油對5種細菌的MIC值(n=3)Table 3 The MIC values of 18 aromatic plant essential oils to 5 bacteria (n=3)

由表3可知，18種芳香植物精油中巖蘭草精油、廣藿香精油和葡萄柚精油無抑菌活性，其他15種植物精油對5種細菌均表現出不同程度的抑菌作用，MIC在0.49～62.5 mg/mL之間，其中月桂、百里香、羅勒和馬郁蘭精油對5種細菌的抑菌效果最強(MIC均為0.49 mg/mL)。研究結果發現不同芳香植物精油對不同細菌的抑菌強度具有一定的差異，茉莉精油對銅綠假單胞菌無抑菌活性，對枯草芽孢桿菌的抑制活性較弱(MIC為62.5 mg/mL)，但對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌則表現出較好的抑菌活性(MIC均為7.81 mg/mL)；佛手柑精油則僅對枯草芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌具有較弱的抑菌活性(MIC均為62.5 mg/mL)。

3.3 MBC值測定

18種芳香植物精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的殺菌效果均不理想，其中僅有依蘭精油對大腸桿菌具有殺菌作用，MBC值為250 mg/mL；月桂、百里香、天竺葵、依蘭和馬郁蘭5種精油對金黃色葡萄球菌具有殺菌作用，其中百里香精油和馬郁香精油的MBC值為125 mg/mL，其余精油的MBC值均為250 mg/mL；依蘭、香茅和天竺葵3種精油對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的殺菌作用相同，MBC值均為250 mg/mL。18種芳香植物精油對肺炎克雷伯氏菌的殺菌效果比較理想(見表4)，其中巖蘭草、廣藿香和葡萄柚3種精油對肺炎克雷伯氏菌無殺菌效果，其余15種精油的殺菌效果表現為：月桂=羅勒=馬郁蘭>百里香>安息香>金盞花=芹菜=依蘭>羅馬洋甘菊=茉莉>天竺葵>佛手柑>茶樹=迷迭香=香茅。

表4 18種芳香植物精油對肺炎克雷伯氏菌的MBC值(n=3)Table 4 The MBC values of 18 aromatic plant essential oils to Klebsiella pneumoniae (n=3)

4 討論

本研究采用體外抑菌試驗方法，對海南島常見18種芳香植物精油體外抑菌活性進行測定和分析，實驗選擇了5種需氧細菌，包括了革蘭氏陰性和陽性菌，MIC和MBC數據與抑菌圈直徑數據趨勢一致，說明所選芳香植物精油中具有良好抑菌效果的精油。MIC實驗中月桂精油、百里香精油、羅勒精油、馬郁蘭精油對5種細菌均表現出最強的抑菌性，與前人[10]報道的月桂精油具有良好的抑菌效果一致，與Singh等、丁華等報道的羅勒具有較強抑菌作用的結論相符合[11-12]；其中香茅精油對3種細菌表現出最強的抑菌性，最小抑菌濃度均為0.49 mg/mL，實驗結果表明這幾種芳香植物精油具有一定的廣譜抑菌效果。但有些精油僅對單一細菌表現出最強的抑菌性，如安息香精油對金黃色葡萄球菌、依蘭精油對大腸桿菌。MBC實驗結果發現18種芳香植物精油僅對肺炎克雷伯氏菌表現出明顯的殺菌作用，其中月桂精油、羅勒精油和馬郁蘭精油的殺菌作用最強，最小殺菌濃度均為0.49 mg/mL。肺炎克雷伯氏菌是引起肺炎的主要致病菌，屬于革蘭氏陰性桿菌，這一結果可為芳香植物精油在醫藥行業中的應用提供一定的參考。18種芳香植物精油對其他4種細菌無殺菌作用或殺菌作用弱，大部分精油對一些細菌只具有抑菌活性，不具備殺菌作用，這可能與精油的組成成分和抑菌機制相關。植物精油為一類化學成分復雜的揮發油類成分，為芳香植物的精制粗提物，不如單一化學藥物具有強有力的殺菌效果，但是其綠色天然，無毒安全，來源廣泛，提取工藝簡單可取，其通過抑菌作用發揮生物活性，在抑菌領域仍然具有巨大的潛在應用價值[13]。

綜上所述，月桂、羅勒和馬郁蘭3種芳香植物精油是綜合抑菌效果最好的3種精油，其次是百里香精油，其他精油也對不同菌種表現出一定的抑菌活性。植物精油可以通過破壞細胞膜功能、影響脂質層穩定及溶解胞體中的脂肪體、抑制菌體中DNA和RNA等物質的合成、影響能量代謝途徑和破壞細菌細胞壁結構這5種途徑發揮抑菌和殺菌作用[14]。目前國內外對精油抑菌機制的報道相對較少，值得進一步的探索和深入研究，為植物精油的抑菌作用提供了理論支撐。