調味香料丁香羅勒精油成分、抗氧化及抑菌活性

杜麗霞，占豪，姜子濤,*

(1.天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700；2.天津商業大學 生物技術與食品科學學院，天津 300134)

丁香羅勒(OcimumgratissimumL.)為屬唇形科羅勒屬植物。該植物在我國的東南部地區(如江西、江蘇、福建、廣東及云南等地)有大面積種植，北美、非洲和亞洲的熱帶和溫帶地區也有廣泛分布。丁香羅勒及丁香羅勒精油(OGEO)具有特殊的香氣，為重要的調味香料，特別是用于制作色拉、披薩、西餐和意大利菜肴。OGEO具有驅蚊蟲、抑菌、抗炎和鎮痛等活性[1-3]。在巴西、肯尼亞和印度等國對OGEO化學成分已有報道。然而，關于我國OGEO化學成分方面的研究卻極少報道。作者在前文中綜述了該精油的成分及其活性研究進展[4]。OGEO的主要成分是丁香酚(EG)，其也是丁香、羅勒、多香果等調味香料的主要成分[5-7]。EG在食品和化妝品行業中用作調味劑和芳香劑，具有抗氧化、殺菌抑菌等生物活性，因而備受關注[8-9]。

本文采用GC-MS技術鑒定了OGEO的化學成分，利用6種不同的方法測定了OGEO的清除游離基能力、抗氧化活性和抑菌活性。并與EG和抗壞血酸(Vc)以及常見的合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)和沒食子酸丙酯(PG)的抗氧化活性進行了比較。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

OGEO：采用水蒸氣蒸餾法制得，由江西天然香料公司提供(江西吉安)，精油含量>95%。鐵氰化鉀：天津化學試劑批發部；磷酸鹽(PBS)和Vc：天津市凱通化學試劑有限公司；BHT：福晨(天津)化學試劑有限公司；PG：浙江省溫州市甌海精細化工公司；EG：上海飛祥化工廠；鄰二氮菲：天津市四通化工廠。所用試劑均為分析純。

Finnigan Trace DSQ GC-MS聯用機(EI離子源、TR-5MS色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm、Mainlib Library 和 Replib Library數據庫) 美國Thermo Fisher公司；UV-2102PC型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；970CRT型熒光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 OGEO成分分析

利用GC-MS技術測定OGEO的化學成分。GC條件：采用程序升溫控制柱箱溫度，以15 ℃/min的升溫速率使柱箱溫度由50℃上升到280 ℃，然后恒溫10 min。載氣(He)流速為1.0 mL/min，進樣量0.3 μL，分流比40∶1。MS條件：電子束能量70 eV；接口和離子源溫度均為250 ℃；質量掃描范圍14～450 m/z。

1.3 OGEO的抗氧化活性

1.3.1 普魯士蘭法

參照文獻[10-11]所采用的普魯士蘭法，測定了OGEO的抗氧化活性。為便于說明和比較OGEO的抗氧化活性，分別利用EG、Vc、BHT和PG來替代OGEO，進行比較測定。

1.3.2 抑制脂質過氧化活性

1.3.2.1 硫氰酸鐵(FTC)法

按照文獻[12]的方法并適當改進，通過測定亞油酸在氧化過程中過氧化物含量的變化，來評價OGEO的抑制脂質過氧化活性。為便于比較，同時也測定了EG、BHT及PG的抑制脂質過氧化活性。

1.3.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

參照文獻[12]的方法并適當改進。本法前期所用試劑及具體做法與FTC法一致。試液在恒溫箱中反應10 d后，每天取該試液1 mL與20%三氯乙酸溶液1 mL混勻后靜置20 min，再加2 mL 0.3% TBA溶液，混勻后置于沸水浴中反應10 min，冷卻至室溫后再以3000 r/min離心20 min，將離心后的上清液在532 nm下測定所生成的丙二醛(MDA)吸光度值，利用下式計算抗氧化活性：

抗氧化活性(%)=[(Ao-As)/Ao]×100%。

(1)

式中：Ao為參比的吸光度，As分別為添加OGEO、EG、BHT或PG后的吸光度。

1.3.3 清除H2O2能力

參照周寧等[13]的方法并加以改進，測定OGEO清除H2O2的能力。具體做法：以PBS緩沖液(0.15 mol/L，pH 7.4)配制20 mmol/L H2O2溶液。取1 mL濃度分別為20，40，60，80，100 μg/mL的OGEO溶液，分別加入2 mL H2O2溶液，混勻，反應10 min后，在230 nm處測定其吸光度值。按照式(1)計算清除H2O2的能力即抗氧化活性。

1.3.4 清除羥基自由基活性

參照文獻[14-15]的方法測定OGEO清除羥基自由基的活性。具體做法：取5支10 mL的比色管，按照表1列出的加入量依次加入所需的試劑，混合均勻后，將上述5支比色管同時置于恒溫水槽中，37 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，然后在波長536 nm處測定吸光值。按照式(2)計算OGEO(或EG、BHT、PG和Vc)的羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率(%)=(As-Ap)/( Ab-Ap)×100%。

(2)

1.3.5 總體抗氧化活性的測定

用稍加改進的Prieto等[16]的方法，具體操作同文獻[11]。對OGEO及EG的總抗氧化活性進行測定，并將測定結果與BHT及PG的總抗氧化活性結果進行比較。

1.4 OGEO的抑菌活性

1.4.1 抑菌直徑

OGEO及EG對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌直徑的測定參照文獻[11]和文獻[17]進行。

1.4.2 最小抑菌濃度(MIC)

OGEO及EG對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌MIC的測定參照文獻[11]和文獻[18]進行。

2 結果與討論

2.1 精油成分分析結果

按選定的GC-MS條件對OGEO進行了分析。利用計算機標準譜庫對比法和保留指數法，從OGEO中鑒定出15種成分，占精油總量的99.62%。OGEO的化學成分及其含量見表2。

表2 丁香羅勒精油(OGEO)的化學成分Table 2 The chemical components of Ocimum gratissimum L. essential oil (OGEO)

2.2 OGEO的抗氧化活性

2.2.1 普魯士蘭法

OGEO、EG、BHT、PG和Vc 5種化合物的抗氧化活性見圖1。化合物提供電子能力的大小，直接反映了其抗氧化活性的強弱。化合物提供電子的能力越強，將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，進而形成普魯士蘭的能力也就越強，溶液在700 nm下的吸光值也就越大，化合物的還原能力越強。由圖1可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc的抗氧化活性隨著濃度的增加而增加。分別對測定結果進行曲線擬合，得到OGEO、EG、BHT、PG和Vc的半抑制濃度(IC50)分別為175.8, 148.6，195.0，89.0，100.2 μg/mL。可見利用普魯士蘭法得到的OGEO等5種化合物的抗氧化活性順序為PG>Vc>EG>OGEO>BHT。

圖1 不同濃度下OGEO等化合物的抗氧化活性Fig.1 The antioxidant activities of OGEO and other compounds at different concentration

2.2.2 抑制脂質過氧化活性

2.2.2.1 硫氰酸鐵法(FTC)

利用FTC法測得的OGEO、EG、BHT和PG的抑制脂質過氧化活性見圖2。吸光值越小，表明化合物的抗脂質過氧化活性越強，其活性順序為OGEO>EG>BHT>PG。由此得出OGEO抑制脂質過氧化物產生的能力要比常見的合成抗氧化劑BHT和PG稍微強一些。而作為OGEO的主要成分EG減少脂質過氧化物產生的活性比OGEO的活性還弱一些。由此可見，OGEO中能夠減少脂質過氧化物產生的主要成分除EG外，還有其他的化學成分，有待于進一步研究。由圖2可知，起初4種化合物抑制脂質過氧化活性曲線變化明顯；但反應6 d后，隨著反應時間的延長，抑制脂質過氧化活性曲線變化不大，說明OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質過氧化物的能力均比較穩定，基本上趨于平緩，不受到時間的影響。

圖2 OGEO等化合物抑制脂質過氧化活性Fig.2 The lipid peroxidation inhibition activities by OGEO and other compounds

2.2.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

利用TBA法測定OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質過氧化結果,見圖3。可以看出OGEO、EG、PG和BHT抑制脂質過氧化物產生的能力依次為OGEO>EG>PG>BHT。與FTC法的結果一樣，OGEO抑制脂質過氧化物產生的活性要比常見的合成抗氧化劑BHT和PG的活性稍強一些；同樣地，作為OGEO主要成分的EG其抑制脂質過氧化物產生的活性也比OGEO稍弱一些。這一結果進一步證實了OGEO中抑制脂質過氧化的活性成分不僅僅是EG。

TBA與FTC有較多相似之處，實驗所用儀器、試劑及實驗要求條件大致相同，不同之處在于兩種方法所用的顯色劑。兩種方法測定抑制脂質過氧化物活性的比較結果見圖3，可見兩種方法還是非常相似的。

圖3 FTC和TBA法比較OGEO、EG、BHT和PG抑制脂質過氧化活性Fig.3 Comparison of lipid peroxidation inhibition activities by OGEO, EG, BHT and PG using FTC and TBA methods

2.2.3 清除過氧化氫能力

在生物體內，超氧化物歧化酶等氧化酶的酶促反應常常形成H2O2，其能透過細胞膜進入細胞內，使細胞內一些酶的巰基氧化失活。OGEO、EG和BHT清除H2O2的結果見圖4，與合成抗氧化劑BHT進行比較，OGEO及EG均顯示出較強的H2O2清除能力，清除率順序為EG>OGEO>BHT，當OGEO、EG和BHT的濃度均為80 μg/mL時，三者對H2O2的清除率分別為71.3%、79.4%和37.6%。這一結果表明OGEO和EG清除H2O2的能力均大于BHT，這是由于精油分子比BHT更容易透過細胞膜進入細胞內。因此，OGEO和EG有較強的清除H2O2能力。

圖4 OGEO、EG和BHT清除H2O2的活性Fig.4 The H2O2 scavenging activities by OGEO, EG and BHT

2.2.4 清除羥基自由基活性(鄰二氮菲法)

OGEO清除·OH的活性見圖5中(A)。為了便于比較，我們將EG、BHT、PG和Vc清除·OH活性的測定結果也一并顯示在了圖5(A)中。由圖5中(A)可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc均能有效地清除·OH游離基，這也是它們均具有抗氧化活性的原因所在。由于5種化合物的用量是相同的，所以OGEO清除·OH的活性最強，比常見的抗氧化劑BHT、PG和Vc都高，清除率達到73.0%；而Vc的清除率最低，僅為30.0%。清除·OH自由基活性順序為OGEO>EG>BHT>PG>Vc。由此可見，天然抗氧化劑清除·OH的能力優于合成的抗氧化劑。而作為OGEO中的主要成分EG，它對·OH的清除率(61.1%)不及OGEO本身，這說明OGEO中可能存在著清除·OH自由基活性比EG還要強的化學成分。OGEO清除·OH自由基活性的結果是精油中化學成分協同作用的體現。

圖5 OGEO等5種化合物清除羥基自由基的活性(A)及OGEO和EG在不同濃度下清除羥基自由基的活性(B)Fig.5 The scavenging activities of hydroxyl radical by OGEO and four other antioxidants (A) and scavenging activities of hydroxyl radicals of OGEO and EG at different concentration (B)

由圖5中(B)可知，OGEO和EG清除·OH自由基活性(Y)與它們的濃度(X)有較好的線性相關性(相關系數R分別為0.992和0.986)。根據二者清除率與濃度的相關曲線可知，OGEO和EG的IC50值分別是80.0 μg/mL和157.4 μg/mL。

2.2.5 總體抗氧化能力

將OGEO、EG、BHT及PG的總抗氧化活性進行比較，結果見圖6。OGEO及EG的總抗氧化活性均比BHT及PG的強一些，其中EG的總抗氧化活性最強，而EG為OGEO的主要成分，這說明EG在精油抗氧化過程中發揮了重要的作用。

圖6 OGEO及EG等化合物的總體抗氧化活性Fig.6 The total antioxidant activities of OGEO, EG and other compounds

2.3 OGEO及EG的抑菌活性

OGEO和EG對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的測定結果見表3。實驗中所用的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均是非常常見的實驗模式菌株，前者為桿菌，后者為球菌，二者的實驗承受力也有所不同，利用這兩種菌株落實抑菌實驗具有實際意義。

表3 OGEO和EG的抑菌能力Table 3 The bacteriostatic abilities of OGEO and EG

由表3可知，OGEO和EG對這兩種細菌均具有抑制作用，并且EG的抑菌圈直徑略大于OGEO。植物精油普遍具有抑菌活性，活性大小與精油成分的分子結構密切相關。萜烯類和萜烯類含氧衍生物均具有一定的抑菌活性，其中酚類化合物的抑菌活性最強，例如前述的EG。由GC-MS分析結果可知，OGEO 中占主導成分的是EG，這使OGEO 和EG均具有很好的抑菌效果，并且EG的抑菌效果大于OGEO。

表4 OGEO和EG的最小抑菌濃度Table 4 The minimum inhibitory concentration of OGEO and EG

由表4可知，OGEO和EG對大腸桿菌的MIC為0.16 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.31 mg/mL，對這兩種微生物的抑菌圈直徑分別為13.0 mm和12.5 mm。Knobloch等[18]認為精油的溶解度與精油中有效成分透過細胞進入菌體的能力直接相關，而抑菌性則基于抑菌劑在菌體細胞膜雙層磷脂中的溶解度。精油中的萜類能夠降低生物膜的穩定性，從而干擾了能量代謝的酶促反應。OGEO中的抑菌成分EG起著重要作用，考慮到EG為萜類物質，由于萜類物質的結構同抑菌性有一定關系，盡管萜類物質的抑菌機理還需進一步研究，但實驗結果為進一步對抑菌機制的研究提供了一定參考依據。

3 結論

利用GC-MS技術鑒定了OGEO的化學成分；并利用普魯士蘭法、硫氰酸鐵法、硫代巴比妥酸法、清除H2O2能力、清除羥基自由基活性、總體抗氧化活性6種不同的方法測定了OGEO的抗氧化活性；初步闡述了精油主要成分與抗氧化活性的相關性。從結果來看，OGEO具有一定的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑使用。不同抗氧化活性的測定方法，反映的是化合物抗氧化活性的不同方面，其抗氧化機理也有所不同。因此，同時利用幾種不同的方法來評價OGEO的抗氧化活性，結論更客觀、更全面、更具有科學性和實際意義。天然抗氧化劑除了具有合成抗氧化劑不可比擬的安全優勢外，在某些方面更優于合成抗氧化劑[19-20]。OGEO對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力也較強，其來源豐富，富含EG，預計丁香羅勒在天然食品抗氧化劑和防腐保鮮中有很好的應用前景。