香蕉秸稈不同還田模式對(duì)土壤微生物群落的影響

孫 鵬，劉滿意，王蓓蓓

（海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海口 570228）

香蕉（Musaspp.）起源于亞洲東南部，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)定為第4 大糧食作物[1?2]。世界上約有130 個(gè)種植香蕉的國(guó)家，中國(guó)是世界上最早種植香蕉的國(guó)家之一。我國(guó)香蕉主要種植區(qū)域分布在廣東、廣西、海南、福建、云南和臺(tái)灣[3]。香蕉具有生長(zhǎng)周期短和產(chǎn)量高等特點(diǎn)，但同樣伴隨著大量的香蕉秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物[4]。有研究表明，長(zhǎng)期的秸稈還田對(duì)土壤細(xì)菌群落的豐富度與多樣性具有積極影響[5]、能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[6]。不同秸稈還田方式也會(huì)影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)或群落組成，如土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)隨著還田量和溝埋深度的增加而變化[7]，還田秸稈的新鮮程度也影響著土壤微生物群落等[8]。香蕉秸稈含有蛋白質(zhì)、纖維素、維生素和某些微量元素[9?10]，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的植物資源，然而有關(guān)香蕉秸稈不同還田方式對(duì)土壤微生物群落影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用[11]，土壤微生物群落還能影響作物的生長(zhǎng)[12]，同時(shí)土壤微生物也是影響土壤質(zhì)量的主要因素之一。研究表明，土壤微生物的組成改變土壤中C 的含量[13]，土壤微生物動(dòng)態(tài)變化與土壤中N 和C 的含量具有相關(guān)性[14]，而且土壤酶活性是由微生物豐度決定的[15]。顧美英等[16]發(fā)現(xiàn)，不同秸稈還田方式對(duì)土壤微生物數(shù)量影響差異顯著。不同秸稈還田方式均能提高土壤微生物活性和豐富度指數(shù)[17]。筆者通過(guò)研究香蕉秸稈在不同模式下還田對(duì)土壤中微生物群落的影響，旨在找出適宜的還田模式，為香蕉秸稈還田技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料土壤采集于海南省臨高縣紅星農(nóng)場(chǎng)香蕉園（位于北緯19°47′N，東經(jīng)109°35′E，海南島的西北部），采集深度為0～20 cm。該蕉園土壤有機(jī)質(zhì)含量為2.33 g·kg?1、pH7.53、堿解氮96.48 mg·kg?1、有效磷115.42 mg·kg?1、速效鉀477.05 mg·kg?1。將采集后的土壤放置于海南大學(xué)試驗(yàn)基地（北緯30°52′N，東經(jīng)121°54′E）并用1 cm 孔徑的篩子篩凈土壤，將其完全混合，隨后裝入3 kg 容量的花盆中。試驗(yàn)所用香蕉秸稈采自于臨高縣紅星農(nóng)場(chǎng)香蕉園，該蕉園種植品種為巴西蕉（Musa nanaLour.），香蕉秸稈為收獲期砍掉的新鮮、健康秸稈（C/N 為29.45∶1）。隨后，將秸稈運(yùn)回海南大學(xué)試驗(yàn)基地，將其粉碎。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究在海南大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)，根據(jù)不同的秸稈還田方法，還田量以蕉園耕作層的實(shí)際秸稈還田量計(jì)算，分為3 個(gè)處理（每個(gè)處理20 次重復(fù)）。處理設(shè)計(jì)：土壤（3 kg）+無(wú)香蕉秸稈還田作為對(duì)照（CK）；土壤（3 kg）+新鮮、粉碎香蕉秸稈（150 g），充分混合，作為秸稈還田掩埋處理（T）；土壤（3 kg）+新鮮、粉碎香蕉秸稈（150 g），將香蕉秸稈覆蓋到土壤上，作為香蕉秸稈自然還田（F）。試驗(yàn)?zāi)M田間灌溉環(huán)境，人為定期澆水。

1.3 采樣方法待秸稈完全腐解后，在花盆內(nèi)0～20 cm 深度隨機(jī)采集土壤樣品（每個(gè)處理7 個(gè)重復(fù)）。將每個(gè)樣品采集的重復(fù)土樣充分混合。將土樣過(guò)2 mm 篩，一部分保存在?20 ℃冰箱用于后續(xù)的DNA提取。

1.4 測(cè)定方法使用PowerSoil DNA Isolation Kits（MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad, USA）按照生產(chǎn)協(xié)議提取土壤DNA，每個(gè)處理設(shè)置5 個(gè)重復(fù)。同時(shí)（NanoDrop 2000, thermosscientific, USA）測(cè)定DNA 的濃度和質(zhì)量（A260/A280的比率）。細(xì)菌16S rRNA（V3+V4）區(qū)域采用引物：5′-ACTCCTACGGGA GGCAG CA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，真菌ITS1 區(qū)域采用引物：5′-CTTGGTCATTTAGA GGAA GTAA-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.5 分析方法一個(gè)分類單元內(nèi)的序列數(shù)除以該組內(nèi)序列的總數(shù)就是相對(duì)豐度。在相同的深度隨機(jī)對(duì)序列重新采樣（16S rRNA 基因的6 415 個(gè)基因序列和ITS 的4 514 個(gè)基因序列），以標(biāo)準(zhǔn)化采樣。利用Excel 2010 基于OUT 計(jì)算微生物門(mén)水平與屬水平相對(duì)豐度。利用MOTHUR 在處理間OTU 豐度矩陣構(gòu)建聚類分析。在OTU 豐度矩陣的基礎(chǔ)上計(jì)算微生物豐富度（SChao1）和多樣性（HShannon），并利用IBM SPSS 20.0 單 因 素 方 差 分 析（one-way analysis of variance）。利用MOTHUR 基于Jaccard 相似度分析處理間微生物群落組成相似差異（PCoA），利用R ggplot2 軟件包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物群落組成3 個(gè)處理（CK、F、T）的微生物群落（圖1）都包含相同的真菌門(mén)（Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Glomeromycota、Microsporidia、Zygomycota），其中Ascomycota 的相對(duì)豐度最高，分別為81.1%、54.7%、68.3%。3 個(gè)處理在細(xì)菌門(mén)水平（Acidoacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、 candidate division WPS-1、 Chloroflxi、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Proteomcetes、Verrucomicrobia、Others）中，Acidoacteria、Actinobacteria、Proteomcetes 為優(yōu)勢(shì)菌種，且相對(duì)豐度均大于10%。圖2 是相對(duì)豐度大于1%的微生物分類屬，真菌屬水平分析結(jié)果表明，T、F、CK處理的Fusarium相對(duì)豐度分別為2.6%、14.3%、15.5%。在細(xì)菌最豐富的分類屬中，各處理中GP6為優(yōu)勢(shì)菌種，且相對(duì)豐度均大于18%。

圖1 不同處理間土壤真菌門(mén)（a）與細(xì)菌門(mén)（b）的相對(duì)豐度Fig.1 Relative phylum-level abundance of fungi (a) and bacteria (b) between treatments

2.2 土壤微生物群落的豐富度與多樣性單因素方差分析（ANOVA）結(jié)果（表1）表明，不同秸稈還田處理間細(xì)菌群落豐富度（Chao1）和多樣性（Shannon）存在顯著差異。與無(wú)香蕉秸稈還田處理（CK）相比，掩埋還田處理（T）的土壤微生物群落的豐富度和多樣性最顯著。與香蕉秸稈自然還田處理（F）相比，掩埋還田處理（T）的土壤微生物群落的豐富度更高，但不同處理間真菌群落豐富度和多樣性差異不顯著。

2.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)聚類分析結(jié)果（圖3）表明，15 個(gè)土壤樣品的微生物群落群落結(jié)構(gòu)明顯分為3 組，分別為3 個(gè)香蕉秸稈還田處理。利用主坐標(biāo)分析（圖4）不同香蕉秸稈還田處理對(duì)土壤微生物群落的影響。從圖4-a 可知，真菌群落的前兩個(gè)主坐標(biāo)解釋了各樣本的34.37%的變化。第1 主坐標(biāo)（PCoA1）T 和F 處理的真菌群落與CK 處理分離良好，第2 個(gè)主坐標(biāo)（PCoA2）結(jié)果表明，3 個(gè)處理之間明顯分離。細(xì)菌群落的前兩個(gè)主坐標(biāo)解釋了各樣本的35.99%的變化，且3 個(gè)處理間的群落分離效果與真菌群落的分離效果相似(圖4-b)。土壤真菌與細(xì)菌OTU 分布結(jié)果（圖5）表明：CK、F、T 處理真菌獨(dú)有OTU 數(shù)量與細(xì)菌獨(dú)有OTU 數(shù)量分別為580、685、548 和429、792、387。CK 與F，T 處理真菌共有OTU數(shù)量和細(xì)菌共有OTU 數(shù)量分別為187、185 和429、265，F(xiàn) 與T 真菌和細(xì)菌共有OTU數(shù)量分別為230、744。

圖2 不同處理間土壤真菌分類屬（a）與細(xì)菌分類屬（b）的相對(duì)豐度（>1%）Fig.2 Relative genus-level abundance (>1%) of soil fungi (a)and bacteria (b) between treatments

表1 不同處理間土壤微生物群落豐富度與多樣性Tab.1 Soil microbial community richness and diversity between treatments

圖3 不同處理間微生物群落聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of microbial communities between treatments

圖4 不同處理間群落微生物主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal coordinate analysis of microbial communities between treatments

圖5 不 同 處 理 間 土 壤 真 菌（a）與 細(xì) 菌（b）OTU 分 類Venn 圖Fig.5 Venn diagram of soil fungal (a) and bacterial (b) OTUs between treatments

3 討 論

秸稈還田作為一種農(nóng)業(yè)管理策略，對(duì)土壤微生物活性有積極的影響[18]。在本研究中，不同香蕉秸稈還田管理對(duì)土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)有顯著差異。3 個(gè)處理中，Ascomycota 為優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，CK、F、T 處理的Basidiomycota的相對(duì)豐度分別為4.7%、7.5%、6%。Basidiomycota 在自然界中起著主要分解纖維素的作用[19]，因此，香蕉秸稈還田為Basidiomycota 在土壤中提供了有益環(huán)境，使其相對(duì)豐度增高。T 處理Fungi_Unidentified 的相對(duì)豐度分別比CK 和F 增高了12.8%和13.7%，可能由于T 處理香蕉秸稈的分解比F 更徹底，造成分解產(chǎn)物方面的差異從而影響Unidentified_Fungi 的相對(duì)豐度[20]。在細(xì)菌門(mén)分類中，以Acidobacteria 和Proteobacteria（圖1-b）為優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)與CK 相比，2 種秸稈還田處理均能使Acidobacteria 的相對(duì)豐度增加，這與CHEN 等人[21]的研究結(jié)果一致。與CK 相比，F(xiàn) 和T 處理土壤中Actinobacteria 的相對(duì)豐度分別增加了3.2%和1.9%，Actinobacteria 是一種非常重要的分解者[22]，這也解釋了秸稈還田處理可使其相對(duì)豐度增高的原因，同時(shí)，一些放線菌同樣對(duì)土壤病原真菌起到拮抗作用[23]。本研究中，真菌分類屬結(jié)果表明（圖2-a），T 處理的Frusarium相對(duì)豐度最低為2.6%，最高為CK（15.5%），而F 處理的Frusarium相對(duì)豐度與CK 處理相比并無(wú)明顯降低，這一結(jié)果說(shuō)明，香蕉秸稈掩埋處理可能起到了降低病原菌的作用，并且對(duì)土壤健康有積極影響，但香蕉秸稈掩埋處理使土壤中Frusarium相對(duì)豐度降低的理論依據(jù)還需要進(jìn)一步研究。

本研究中，香蕉秸稈還田方式土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性存在顯著差異，其中，T 處理細(xì)菌群落的豐富度最高，并且T 和F 的多樣性均與CK 存在顯著差異。細(xì)菌群落的變化是多種復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果[24?25]，而本研究中秸稈還田方式為唯一的因素。但各處理的真菌群落豐富度和多樣性并無(wú)差異，說(shuō)明香蕉秸稈還田對(duì)細(xì)菌群落豐富度和多樣性的影響遠(yuǎn)高于真菌。基于OTU 組成的聚類分析、主坐標(biāo)分析、OTU 數(shù)量分布結(jié)果均顯示，T 處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與F 處理相近且與CK 處理明顯不同。并且，無(wú)論是在第1 主坐標(biāo)還是第2 主坐標(biāo)上，秸稈掩埋處理均顯著與對(duì)照分開(kāi)。因此，相比于表面覆蓋，香蕉秸稈的掩埋處理（T）更容易改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

本研究結(jié)果表明，相比于香蕉秸稈不還田處理（CK）和香蕉秸稈自然還田處理（F），香蕉秸稈掩埋還田處理（T）對(duì)土壤微生物群落具有更積極的影響。香蕉秸稈還田為某些具有分解功能的微生物提供了有益的土壤環(huán)境，并且香蕉秸稈掩埋還田處理（T）降低了土壤中Frusarium的相對(duì)豐度，提高了細(xì)菌群落多樣性與豐富度。因此，在本研究條件下，香蕉秸稈掩埋還田處理（T）為適宜、安全的秸稈還田方式。