鱷魚源氣單胞菌的毒力基因與耐藥特性分析

韓 語，王 昕，潘紀汶，楊 諾，郭桂英，李 遷，曾紀鋒，鄭繼平

（1.海南大學 生命科學與藥學院，海口 570228; 2.海南大學 理學院，海口 570228;3.海南大學 網絡與技術中心，海口 570228; 4.海南大學 動物科技學院，海口 570228）

氣單胞菌（Aeromonas）屬于革蘭氏陰性菌，主要存在于各種水生環境中，分為致病菌株和非致病菌株，致病菌株可感染兩棲類、魚類、鳥類、哺乳類、爬行類等動物，常引起水產養殖動物的細菌性敗血癥[1]，導致養殖的動物大量死亡，對水產養殖產業造成嚴重的危害。此外，氣單胞菌還可引起人類的敗血癥、胃腸炎、傷口感染、腹腔感染、呼吸道感染等疾病[2?3]，引發嚴重的公共健康問題。因此，探討鱷魚源氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性的關系，對其致病機制的理解，控制氣單胞菌對鱷魚養殖的危害有著重要的意義。自2016 年以來，海南陵水、文昌等地多家鱷魚養殖場發生了多起暹羅鱷死亡事件，研究人員己從發病鱷魚體內分離到多株氣單胞菌[4?6]。筆者對10 株臨床分離到的鱷魚源氣單胞菌菌株進行了相關的毒力基因和耐藥基因的檢測以及抗生素藥物敏感性測定，旨在了解鱷魚中氣單胞菌毒力基因攜帶和耐藥特性，為探討鱷魚源氣單胞菌的致病機制，以及在鱷魚養殖中該病的有效防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑酵母提取物，蛋白胨來自英國OXOID 公司；抗菌藥物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Isolation Kit）購自北京華越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix 為北京艾德萊生物科技有限公司產品；DNA 5000 Marker 和DNA 2000 Marker 來自廣州東盛生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠為法國Biowest 公司產品。

1.2 氣單胞菌菌株病料樣品來自于2016—2018 年間海南文昌、陵水地區鱷魚養殖場的18 月齡以內的患病暹羅鱷魚，經過分離培養、生理生化及分子生物學鑒定，獲得了10 株氣單胞菌臨床菌株，其中，包括5 株嗜水氣單胞菌，3 株達卡氣單胞菌，1 株簡達氣單胞菌和1 株維氏氣單胞菌。

1.3 細菌基因組提取分別挑取10 株氣單胞菌單菌落于LB 液體培養基中在30 ℃下培養16 h，然后按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明分別對10 株氣單胞菌的基因組進行提取，通過Nanophotometer儀器測定其濃度和純度，然后保存于?20 ℃冰箱中。

1.4 毒力基因的檢測以分離得到的10 株氣單胞菌的基因組為模板，利用毒力基因檢測引物（表1）分別進行PCR 擴增，反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，47.4～55.4 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃終延伸10 min。9 種毒力基因分別為：Ⅲ型分泌系統內膜組分基因（Type Ⅲ secretion system inner membrane component,ascV）、ADP?核糖基化毒素基因（ADP-ribosylating toxin,aexT）、胞外毒力因子氣溶素基因（Aerolysin,aer）、細胞興奮性腸毒素基因（Excitatory enterotoxin,alt）、細胞毒性腸毒素基因（Cytotoxic enterotoxin,act）、熱穩定腸毒素基因（Heat stable enterotoxin,ast）、磷脂酶基因（Lipase,lip）、彈性蛋白酶基因（Elastase,ela）、鞭毛蛋白基因（Flagella,fla）。

表1 氣單胞菌毒力基因引物Tab.1 Primers of Aeromonas virulence genes

1.5 耐藥基因的檢測以分離得到的10 株氣單胞菌的基因組為模板，利用表2 中的耐藥基因檢測引物分別進行PCR 擴增，反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40.0～59.7 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃10 min。9 種耐藥基因包括：喹諾酮類藥物耐藥基因qnrA、qnrS；四環素類藥物耐藥基因tetA、tetC；氨基糖苷類藥物耐藥基因ant3、strA；磺胺類藥物耐藥基因sul1；β?內酰胺類藥物耐藥基因tem、ctxM。

1.6 藥敏試驗利用紙片擴散法（Kirby-Bauer 法）進行氣單胞菌的抗生素藥物敏感性測定，通過產生的抑菌圈直徑大小判定病原菌對藥物的敏感性，根據美國臨床和實驗室藥敏操作標準[11]可分為耐藥（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。抗菌藥物藥敏紙片主要包括β?內酰胺類抗生素中青霉素類氨芐西林、阿莫西林以及頭孢菌素類頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢曲松；氨基糖苷類抗生素卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素；四環素類抗生素米諾環素、四環素；喹諾酮類抗生素依諾沙星、萘啶酸、恩諾沙星、環丙沙星；磺胺類抗生素磺胺異惡唑、甲氧芐啶；糖肽類抗生素萬古霉素；氯霉素類抗生素氯霉素、氟苯尼考；碳青霉烯類抗生素亞胺培南。

表2 氣單胞菌耐藥基因引物Tab.2 Primers of antibiotic-resistant genes of Aeromonas

2 結果與分析

2.1 毒力基因檢測結果以10 株氣單胞菌基因組為模板，利用9 種毒力基因的引物分別進行PCR 擴增，結果如表3 所示，除ascV 和aexT 基因陽性檢出率較低外，其余7 種毒力基因檢出率均大于50%，其中，lip和ela基因檢出率高達100%。相比之下，嗜水氣單胞菌中C1、C2、C3 以及維氏氣單胞菌C4 這4 株菌株毒力基因攜帶率較高，可以達到77.8%。

2.2 耐藥基因檢測結果以10 株氣單胞菌基因組為模板，利用9 種耐藥基因的引物分別進行PCR 擴增（表4）。從表4 可知，9 種耐藥基因陽性檢出率偏高，均大于50%。其中，嗜水氣單胞菌C2 和C3 以及簡達氣單胞菌C7 這3 株菌里9 種耐藥基因攜帶率高達100%。

2.3 藥物敏感性從表5 可知，10 株氣單胞菌對喹諾酮類抗生素、四環素類抗生素、氨基糖苷類抗生素、氯霉素類抗生素和碳青霉烯類抗生素的敏感率較高，均大于60%，其中對慶大霉素、四環素、卡那霉素、依諾沙星、環丙沙星和氟苯尼考的敏感率高達90%以上；而對于β?內酰胺類抗生素、磺胺類抗生素和糖肽類抗生素耐藥率較高，其中，對于阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢唑啉和萬古霉素的耐藥率超過80%，但對三代頭孢中的頭孢曲松敏感率較高。

表3 毒力基因鑒定結果Tab.3 Identification of virulence genes of Aeromonas

表4 耐藥基因鑒定結果Tab.4 Identification of antibiotic resistant genes of Aeromonas

表5 藥物敏感性鑒定Tab.5 Identification of antibiotic sensitivity

續表5 Tab. 5 continued

3 討 論

目前，普遍認為氣單胞菌致病機制主要通過傷口與黏膜系統感染，參與感染的致病因子主要是具粘附作用的鞭毛、菌毛、外膜蛋白。氣單胞菌的致病性強弱與其攜帶的多種毒力因子有關，毒力因子主要包括胞外毒素（氣溶素、溶血素、細胞興奮性腸毒素、細胞毒性腸毒素）、胞外蛋白酶、S 層、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等[12]。本研究中，10 株氣單胞菌中的ascV 和aexT 基因檢出率較低，而另外7 種毒力基因檢出率均大于50%，其中，磷脂酶基因lip和彈性蛋白酶基因ela檢出率高達100%，不同種的氣單胞菌毒力基因攜帶率均偏高。

胡萌[13]和吳亞鋒[14]報道了氣單胞菌中經檢測發現腸毒素相關基因alt、act陽性率在68%以上，攜帶率也較高，而氣溶素基因aer檢出率為47%；范騰飛[15]發現，58 株氣單胞菌中含腸毒素相關基因的菌株占24.1%～81%，磷脂酶基因lip檢出率為75.9%，氣溶素基因aer為41.4%；SEN 等[9]研究發現，氣單胞菌中lip基因檢出率為88%，alt、act、ast基因檢出率在30%～70%。筆者在本次研究中發現，氣溶素、腸毒素、蛋白酶等幾種主要毒力基因檢出率較高，都在50%以上，有些甚至達到100%。多種毒力基因的存在會大大增強氣單胞菌病原菌的致病性，很可能對鱷魚養殖業造成嚴重危害，應當引起高度重視。

本研究中，耐藥基因檢測結果表明，氣單胞菌中9 種耐藥基因陽性率都大于50%，其中嗜水氣單胞菌C2 和C3 以及簡達氣單胞菌C7 耐藥基因檢出率高達100%。對應的抗生素藥物敏感性檢測結果與耐藥基因結果有所不同，藥敏試驗中10 株氣單胞菌對喹諾酮類抗生素、四環素類抗生素、氨基糖苷類抗生素、氯霉素類和碳青霉烯類抗生素的敏感率較高，但在耐藥基因檢測中，均有檢測出10 株氣單胞菌對這幾類抗生素的耐藥基因。這可能是由于細菌體內復雜的作用機制，耐藥基因并沒有得到順利表達，這種情況在TRUDEL 等[16]的研究中也有相似的結果。馬辰婕等[1]通過檢測氣單胞菌的耐藥基因，發現檢出率最高的是β?內酰胺類耐藥基因，陽性率高達83.7%，其次是磺胺類、氨基糖苷類和四環素類耐藥基因，均高于40%，而喹諾酮類耐藥基因qnrB 和qnrS 未檢測到。在本次實驗中，5 類耐藥基因檢出率都偏高，除tetC 外，其余8 種耐藥基因陽性率都高于80%。

由于氣單胞菌種類繁多，水產養殖動物受外界環境以及所用的抗菌藥物種類和頻率不同，所以即使同一種氣單胞菌對藥物的敏感性也有差異。何秋麗[17]發現，氣單胞菌對阿莫西林、氨芐西林等耐藥性強，對二、三代頭孢和碳青霉烯類抗生素敏感；李皇[18]等的研究結果表明，大多數氣單胞菌對青霉素耐藥，對氨基糖苷類、碳青霉烯類、四環素類、喹諾酮類和氯霉素類抗生素敏感；CARNAHAN 等[19]報道了氣單胞菌對氨芐西林、頭孢唑啉以及頭孢噻吩耐藥，這些研究結果與本次實驗結果基本一致。暹羅鱷的養殖環境以及抗生素使用的種類和次數都會影響到氣單胞菌的藥物敏感性。因此，在鱷魚細菌性疾病的防治中，應加強耐藥情況的監測，選擇有效的抗菌藥物并交替使用，以減少病原細菌耐藥率的發生。

在國內，鱷魚養殖還是一個新興產業，暹羅鱷病原菌方面的研究報道很有限，鱷魚養殖業要健康發展，鱷魚病害研究的重要性不言而喻。本研究從患病暹羅鱷體內分離出的10 株氣單胞菌進行毒力基因、耐藥基因以及藥物敏感性的檢測和分析，可為暹羅鱷病害防治及有效的抗菌藥物篩選提供參考。