苦蕎FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及組織表達分析

段迎 楊曉琳 蔡蘇云 賀潤麗 尹桂芳 王艷青 盧文潔 孫道旺 王莉花

摘要：【目的】克隆苦蕎肉桂醇脫氫酶（CAD）基因并分析其組織表達特性，為深入研究CAD基因在苦蕎果殼形成中的分子調控機制提供理論依據。【方法】基于苦蕎轉錄組測序結果，從苦蕎厚果殼品種云蕎1號和薄果殼品種小米蕎克隆CAD基因，對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CAD基因在不同果殼厚度類型（厚果殼苦蕎和薄果殼苦蕎）不同組織的表達情況?！窘Y果】從薄果殼苦蕎和厚果殼苦蕎中均克隆獲得2條苦蕎CAD基因，且這2條基因序列在薄果殼苦蕎與厚果殼苦蕎中均完全一致，命名為FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的開放閱讀框（ORF）長度為876 bp，編碼291個氨基酸殘基，為疏水性的穩定酸性蛋白，定位于細胞核和細胞質;FtCAD-2基因的ORF長度為1083 bp，編碼360個氨基酸殘基，為親水性的穩定酸性蛋白，定位于細胞質。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3個典型的保守結構域，且不具有跨膜結構域和信號肽，屬于非分泌蛋白。FtCAD-1與數據庫目標蛋白2cf5.1.B的結構相似度為74.74%，而FtCAD-2與數據庫目標蛋白5z0c.1.A的結構相似度為63.03%。FtCAD-1與擬南芥的第一類CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的親緣關系較近;FtCAD-2與擬南芥的第二類CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的親緣關系較近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在種仁中的相對表達量最高，且厚果殼苦蕎與薄果殼苦蕎間無顯著差異（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎葉、花和果殼中的相對表達量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01）高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎果殼中相對表達量是薄果殼苦蕎的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果殼苦蕎果殼中相對表達量顯著高于厚果殼苦蕎外，在其他組織中的相對表達量均表現為厚果殼苦蕎高于薄果殼苦蕎。【結論】FtCAD-1屬于第一類CAD基因，具有明顯的組織表達特異性，推測其在苦蕎木質素生物合成過程中發揮重要調控作用。

關鍵詞： 苦蕎;肉桂醇脫氫酶（CAD）;RT-PCR克隆;生物信息學分析;實時熒光定量PCR

中圖分類號： S517.035.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3340-10

Cloning and tissue expression analysis of FtCAD-1 and FtCAD-2 genes from tartary buckwheat

DUAN Ying1， YANG Xiao-lin1， CAI Su-yun1， HE Run-li1*， YIN Gui-fang2，

WANG Yan-qing2， LU Wen-jie2， SUN Dao-wang2， WANG Li-hua2*

（1School of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan? 030619， China; 2Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Biotechnology and Genetic Germplasm Resources Research Institutes/Yunnan Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology/Key Laboratory of Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm Innovation，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】To clone the cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD） gene of tartary buckwheat and analyze its tissue expression characteristics， in order to provide a theoretical reference for further study of the molecular mechanism underlying CAD gene regulation during the formation of the thin husk of tartary buckwheat. 【Method】The CAD gene of tartary buckwheat with thin husk （Yunqiao 1） and tartary buckwheat with thick husk （rice buckwheat） was cloned based on the related fragments of tartary buckwheat transcriptome and analyzed by bioinformatics. The expression of CAD in different tissues of the different husk types（thin husk and thick husk） was studied by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】Two CAD genes of tartary buckwheat were cloned from tartary buckwheat with thin and thick husks，and found to be completely identical to FtCAD-1 and FtCAD-2. The open reading frame（ORF） of FtCAD-1 gene was 876 bp in length and encoded 291 amino acid residues. It was predicted to be a hydrophobic stable acidic protein and was located in the nucleus and cytoplasm. The ORF of FtCAD-2 gene was 1083 bp in length and encoded 360 amino acid residues predicted to be a hydrophilic and stable acidic protein located in the cytoplasm. Both proteins had three typical conserved domains of CAD proteins，but did not have transmembrane domains or signal peptides， and so belong to non-secreted proteins. The structural similarity between FtCAD-1 and the database target protein 2cf5.1.B was 74.74%， while the structural similarity between FtCAD-2 and the database target protein 5z0c.1.A was 63.03%. FtCAD-1 was closely related to the first type of protein （AtCAD4， AtCAD5） in Arabidopsis lignin synthesis， but FtCAD-2 was closely related to the second type of CAD protein （AtCAD2， AtCAD3， AtCAD6 et al.） in Arabidopsis. The relative expression levels of FtCAD-1 and FtCAD-2 genes were the highest in the seed kernels， where there was no significant difference observed between the thick-husk and the thin-husk tartary buckwheat types（P>0.05）. The relative expression of FtCAD-1 gene in the leaves，flowers and husks of tartary buckwheat with thick husks was significantly （P<0.05， the same below） or very significantly （P<0.01） higher than those in tartary buckwheat with thin husks. This was most notable in the husks，where the relative expression level of FtCAD-1 thick husked tartary buckwheat was 16 times higher than that in tartary buckwheat with thin husk. In contrast，the relative expression level of the FtCAD-2 gene was significantly higher in thin husks than that in thick husks， while in other tissues FtCAD-1 showed a higher relative expression level in thick husked tartary buckwheat than that in thin husked tartary buckwheat. 【Conclusion】The FtCAD-1 gene belongs to the first type of CAD gene， it has tissue expression specificityand plays an important role in the regulation of lignin biosynthesis in tartary buckwheat.

Key words：tartary buckwheat; cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD）; RT-PCR cloning; bioinformatics analysis; real-time fluorescence quantitative PCR

Foundation item： Construction Project National Technical System of Oat and Buckwheat Industry（CARS-07-C-2）;Key Research and Development Project of Shanxi（201803D221012-6）; Shanxi Province Natural Science Research General Project（20210302123231）

0 引言

【研究意義】苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn]具有利耳目、續精神、益氣力等功效，是我國藥食同源文化的典型體現（王世霞等，2016;周良等，2019）?？嗍w果殼較厚，殼比率可達20%～30%，果殼十分堅韌，脫殼困難，從而難以實現生產整粒的苦蕎米，無法高效獲得具有高蘆丁含量的麩皮層全營養苦蕎米，很大程度上降低了苦蕎米的營養功效（陳慶富等，2015）。研究發現，薄果殼苦蕎的果殼木質素含量較厚果殼苦蕎低（吳朝昕等，2020），更受人們的青睞。雖然目前關于苦蕎薄果殼形成的原因尚不清楚，但研究證實肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質素特異合成途徑中最后一步的催化酶，在木質素生物合成過程中發揮重要作用。因此，克隆苦蕎CAD基因并進行生物信息學分析，對探究CAD在苦蕎薄果殼形成的作用機制及培育薄果殼苦蕎均具有重要的意義。【前人研究進展】CAD屬于NADPH依賴性酶家族，含有CAD蛋白家族的甘氨酸NADP（H）輔酶結構域GLGGV（L）G及2個Zn2+結合位點：GHE（X）2G（X）5G（X）2V和GD（X）9，10C（X）2C（X）2C（X）7C（Chao et al.，2014）。自Knight等（1992）首次從煙草莖部克隆獲得CAD基因以來，陸續從番薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]（Kim et al.，2010）、馬尾松[Pinus massoniana Lamb.]（張逢凱等，2014）、高梁（Sorghum vulgare Pers.）（王麗華等，2015）、香椿[Toona sinensis （A. Juss.） Roem.]（隋娟娟等，2019）等多種植物中克隆獲得。韓國粉（2014）通過轉錄組測序分析，篩選出軟核山楂與硬核山楂間的差異表達基因，結果發現CAD基因在軟核山楂果實中的相對表達量較硬核山楂顯著下調。龔凌燕（2014）對不同石榴品種的籽粒中PgCAD基因的表達水平進行分析，結果發現PgCAD基因在紅玉石籽、白玉石籽、粉皮、會理軟籽和蒙自甜石榴4個石榴品種籽粒中的相對表達量與籽粒種皮總木質素含量呈正相關。張穎俊（2015）研究發現干旱脅迫下油菜CAD基因表達水平與莖稈和根系中的木質素含量均呈顯著正相關?？梢?，CAD基因在木質素生物合成過程中發揮著重要調控功能，將芥子醛、松柏醛和香豆醛催化還原成木質素單體的前體物質芥子醇、松柏醇和香豆醇（Pandey et al.，2011）。近年來，從苦蕎克隆獲得的基因主要包括查爾酮合成酶基因（FtCHS1和FtCHS2）（孫朝霞等，2014）、類黃酮3′-羥化酶基因（FtF3′H）（李雙江等，2014）、4-香豆酸輔酶A連接酶基因（Ft4CL）（凌瑤等，2015）、肉桂酸-4-羥基化酶基因（C4H）（劉榮華等，2017）等，其中大部分基因屬于黃酮生物合成支路，而在木質素生物合成支路的基因研究鮮見報道?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期對厚果殼品種云蕎1號和薄果殼品種小米蕎進行轉錄組測序分析，結果發現大多數木質素生物合成相關基因在云蕎1號的表達量高于小米蕎，說明這些基因在苦蕎果殼形成過程中發揮重要的調控作用。但對于這些基因的克隆及表達分析等相關研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】基于前期苦蕎轉錄組測序結果，克隆厚果殼苦蕎品種云蕎1號和薄果殼苦蕎品種小米蕎的CAD基因（FtCAD-1和FtCAD-2），對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CAD基因在不同果殼類型苦蕎不同組織的表達模式，為研究苦蕎薄果殼形成的分子調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的薄果殼品種小米蕎為云南地方品種。供試的苦蕎厚果殼品種云蕎1號為云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所選育品種。分別取2個供試品種不同發育期的果實，剝離果殼，按品種混合在一起作為基因克隆材料。采用云蕎1號和小米蕎結實期的葉、花、莖、果殼和種仁等不同組織用于qRT-PCR檢測檢測。主要試劑：Trizol提取試劑盒（B511321）、柱式DNA膠回收試劑盒（B518131）、M-MuLV Reverse Transcriptase和RNase H（B500517）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;TaKaRa LA Taq（DRR02AG）、瓊脂糖B（BBI，A600014）、4S Red Plus 核酸染色劑（10000×水溶液，BBI，A606695）、2×SG Fast qPCR Master Mix（BBI，B639271）等。主要儀器設備：PCR反應擴增儀（加拿大，BBI）、YXJ-2離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、DYY-8型穩壓穩流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）、SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠）、FR980凝膠成像系統（上海復日科技有限公司）、U-3010紫外-可見分光光度計（Hitachi）、SMA4000微量分光光度計（Merinton Instrument，Inc）、HC-2518R高速冷凍離心機（安徽中科中佳儀器有限公司）和LightCycler480型熒光定量PCR儀（Rotkreuz，Switzerland）等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 利用Trizol提取試劑盒提取云蕎1號和小米蕎不同發育期的果殼混合材料的總RNA，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。采用cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。

1. 2. 2 基因克隆 基于苦蕎轉錄組分析結果，根據CAD基因序列設計2對特異引物（表1）。以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 μL，40 ng/μL的DNA模板1.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，雙蒸餾水補充至25.0 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行33個循環;72 ℃ 7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，再和用柱式DNA膠回收試劑盒進行目的片段回收純化，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 2. 3 生物信息學分析 利用NCBI數據庫的ORFfinder和Conserved domains對開放閱讀框（ORF）及保守功能結構域進行預測分析。通過ProtParam對蛋白的理化性質進行預測分析;利用ProtScale對蛋白的親疏水性進行預測分析。通過TMHMM Server v.2.0、SignalP 5.0 Server、NetPhos 3.1 Server和Psort對蛋白的跨膜結構域、信號肽、磷酸化位點和亞細胞定位進行預測分析。利用SOPMA和SWISS-MODEL進行蛋白的二、三級結構預測。利用DNAMAN 9.0對GenBank中的同源蛋白進行氨基酸序列多重序列比對分析。同時，采用MEGA 6.0的鄰接法構建不同物種CAD蛋白的系統發育進化樹。

1. 2. 4 qRT-PCR檢測 采用Trizol總RNA抽提試劑盒分別提取厚果殼和薄果殼苦蕎的不同組織（葉、花、莖、果殼和種仁）總RNA，并利用Maxima Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR檢測。反應體系：2×SG Fast qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下引物（表1）各0.4 μL，40 ng/μL cDNA模板2.0 μL，雙蒸餾水補充至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行45個循環。以苦蕎基因H3為內參，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2. 1 總RNA提取及基因克隆結果

分別提取云蕎1號和小米蕎不同發育期的果殼混合材料總RNA，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，RNA條帶清晰可見，28S RNA和18S RNA亮度比為1∶1～2∶1，表明RNA基本未降解，可用于基因克隆。利用RT-PCR均從薄果殼苦蕎和厚果殼苦蕎中克隆獲得2條片段，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，2條片段的大小約1000 bp（圖2）。對這2條片段進行回收測序，結果發現2條CAD基因序列在薄果殼苦蕎與厚果殼苦蕎中均完全一致，命名為FtCAD-1（GenBank登錄號：MW455112）和FtCAD-2（GenBank登錄號：MW455113）。FtCAD-1基因的開放閱讀框（ORF）長度為876 bp，編碼291個氨基酸殘基;FtCAD-2基因的ORF長度為1083 bp，編碼360個氨基酸殘基（圖3）。

2. 2 生物信息學分析結果

2. 2. 1 理化性質預測分析結果 ProtParam預測結果顯示，FtCAD-1蛋白的分子式C1401H2238N372O416S15，理論分子量31430.33 Da，理論等電點（pI）6.14，親水性平均系數0.093，不穩定系數35.00，為疏水性的穩定酸性蛋白;FtCAD-2蛋白的分子式C1743H2759N465O515S21，理論分子量39142.15 Da，pI 6.75，親水性平均系數-0.036，不穩定系數25.52，為親水性的穩定酸性蛋白（表2）。ProtScale預測結果顯示，FtCAD-1蛋白的最高分值（2.278）出現在多肽鏈中的第211位氨基酸，說明該氨基酸疏水性最強;最低分值（-2.678）出現在多肽鏈中的第49位氨基酸，說明該氨基酸親水性最強。FtCAD-2蛋白的最高分值（2.100）出現在多肽鏈中的第98位氨基酸，說明該氨基酸疏水性最強;最低分值（-3.211）出現在多肽鏈中的第35位氨基酸，說明該氨基酸親水性最強。NetPhos3.1 Server預測結果顯示，FtCAD-1蛋白的磷酸化位點共有27個，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分別為14、9和4個;FtCAD-2蛋白的磷酸化位點有30個，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分別為16、12和2個。推測這些位點氨基酸發生磷酸化反應，從而對FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的活性和生物學功能發生調控作用。TMHMM預測結果顯示，FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均不具有跨膜結構域。SignalP 5.0 Server預測結果顯示，FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均不具有信號肽，屬于非分泌蛋白。Psort預測結果顯示，FtCAD-1主要分布于細胞核和細胞質中;FtCAD-2主要分布于細胞質中。

2. 2. 2 結構域預測分析結果 對FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的保守結構域（Conserved domains）進行預測分析，結果顯示，FtCAD-1屬于PLNO2514超基因家族，FtCAD-2屬于PLNO2586超基因家族（圖4）。

2. 2. 3 蛋白結構預測 通過SOPMA對蛋白的二級結構進行預測，結果發現FtCAD-1蛋白的二級結構由無規則卷曲（占37.80%）、α-螺旋（占26.46%）、延伸鏈（占25.77%）和β-折疊（占9.97%）;FtCAD-2蛋白的二級結構由無規則卷曲（占44.44%）、α-螺旋（占23.89%）、延伸鏈（占24.72%）和β-折疊（占6.94%）（圖5）組成。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的三級結構預測，結果如圖6所示。FtCAD-1蛋白與數據庫目標蛋白2cf5.1.B的結構相似度為74.74%，QMEAN值為-1.22，GMQE值為0.85，說明建?？尚哦容^高。FtCAD-2蛋白與數據庫目標蛋白5z0c.1.A的結構相似度為63.03%，QMEAN值為-0.87，GMQE值為0.82，說明建?？尚哦容^高。

2. 2. 4 氨基酸序列分析及系統發育進化樹構建

利用NCBI數據庫中的BLASTp搜索FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的同源序列，結果顯示，FtCAD-1蛋白與GenBank中的同源序列包括蕪青（Brassica rapa L，XP—009101881.2）、歐洲油菜（B. napus L，XP—013644950.1）、番茄（Solanum lycopersicum L，XP—004235066.2）、麻風樹（Jatropha curcas L，XP—012075299.1）、澳洲棉（Gossypium australe，KAA345 7323.1）、橡膠樹[Hevea brasiliensis（Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg.，XP—021692374.1]、梅（Prunus mume，XP—008236378.1）、胡桃（Juglans regia L，XP—018 827699.1）、美洲棉（G. raimondii，KJB4736 1.1）和陸地棉（G. hirsutum L，ABZ01817.1）的CDA氨基酸序列相似性為75.26%～79.73%;FtCAD-2蛋白與GenBank中上述同源序列的氨基酸序列相似性為74.04%～79.89%。利用DNAMAN 9.0將FtCAD-1和FtCAD-2與其他物種的同源序列進行比對分析，結果顯示FtCAD-1和FtCAD-2與其他植物的CAD蛋白均含有3個CAD蛋白家族的典型保守結構域（圖7）。

運用MEGA 6.0構建擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.） Heynh.]的9個AtCAD蛋白、其他7種植物的CAD蛋白及FtCAD-1和FtCAD-2的系統發育進化樹，結果如圖7所示。這些蛋白可分成3支，FtCAD-1和FtCAD-2蛋白分別聚在不同分支。其中，FtCAD-1與擬南芥AtCAD4和AtCAD5、葡萄（Vitis vinifera L.）VvCAD1、黃花蒿（Artemisia annua L.）AaCAD、橡膠樹HbCAD、煙草（Nicotiana tabacum L.）NtCAD1、銀合歡[Leucaena leucocephala（Lam.） de Wit]LlCAD聚為一支，屬于第一類CAD蛋白。由于AtCAD4和AtCAD5蛋白在擬南芥木質素的合成中發揮重要作用（Jourdes et al.，2007），由此推測FtCAD-1蛋白在苦蕎木質素的合成中發揮重要作用。由于FtCAD-2與擬南芥的AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8、AtCAD9及陸地棉GhCAD9和番薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]IbCAD聚為一個分支，屬于第二類CAD蛋白。AtCAD1蛋白單獨聚為一個分支，屬于第三類CAD蛋白。

2. 3 基因組織表達特性分析結果

qRT-PCR檢測苦蕎FtCAD-1和FtCAD-2基因在厚果殼與薄果殼苦蕎不同組織中的表達水平，結果如圖9所示。FtCAD-1和FtCAD-2基因在不同組織的表達水平存在明顯差異。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在種仁中的相對表達量最高，且厚果殼與薄果殼苦蕎間無顯著差異（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎葉、花和果殼中的相對表達量顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎果殼中相對表達量是薄果殼苦蕎的16倍，但在薄果殼苦蕎莖中的相對表達量顯著高于厚果殼苦蕎。FtCAD-2基因除了在薄果殼苦蕎果殼中相對表達量顯著高于厚果殼苦蕎外，在其他組織中的相對表達量均表現為厚果殼苦蕎高于薄果殼苦蕎，尤其是在厚果殼苦蕎花和莖的相對表達量顯著高于薄果殼苦蕎。由此推測FtCAD-1基因為控制苦蕎厚薄果殼性狀的關鍵基因。

3 討論

苦蕎有“五谷之王”“三降食品”的美稱，營養價值和藥用功效極高。但目前市面上的栽培苦蕎大部分難以脫殼，嚴重影響了有效成分的利用。通過基因工程的方法探究厚果殼形成的調控機制已成為研究熱點。CAD作為植物木質素合成過程中的重要限速酶，能將不同的肉桂醛轉化為相應的肉桂醇，進而影響木質素的結構及形成，是非常理想的調控木質素合成的控制酶（Tobias and Chow，2004）。已有較多研究表明，CAD基因在木質素合成途徑中發揮重要調控作用，且其表達量與木質素含量成正相關（劉莉等，2013;胡丹等，2015;郭永翠等，2020）。本研究從厚果殼苦蕎品種云蕎1號和薄果殼苦蕎品種小米蕎均克隆獲得FtCAD-1和FtCAD-2基因，qRT-PCR檢測發現二者在葉、花、莖、果殼和種仁中均有表達，但相對表達量存在明顯差異。FtCAD-1基因在厚果殼苦蕎果殼中的相對表達量是薄果殼苦蕎的16倍，二者的差異達極顯著水平，而FtCAD-2基因在薄果殼苦蕎的相對表達量顯著高于厚果殼苦蕎。通過序列比對分析發現，厚果殼苦蕎的FtCAD-1和FtCAD-2基因序列與薄果殼苦蕎的FtCAD-1和FtCAD-2基因序列完全一致，而基因表達受到多種因素的影響，如啟動子、轉錄因子的激活、光照、時間、溫度等，推測FtCAD-1基因可調控苦蕎果殼的木質素合成進而影響果殼厚度。

前人研究發現，CAD以多基因家族的形式存在，不同植物的CAD基因數目不同，功能也不同。例如模式植物擬南芥中主要存在9個CAD基因，其中AtCAD4和AtCAD5屬于第一類CAD基因，均參與維管束的發育過程，在木質素的生物合成過程中將松柏醛和芥子醛還原為相應的醇;AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8和AtCAD9屬于第二類CAD基因，AtCAD1屬于第三類CAD基因（Kim et al.，2004）。本研究的系統進化分析結果顯示，FtCAD-1與擬南芥的AtCAD4和AtCAD5聚在一支，故推測FtCAD-1基因屬于第一類CAD基因，參與調控木質素生物合成;FtCAD-2與擬南芥的AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6、AtCAD7、AtCAD8、AtCAD9等聚在一支，故推測FtCAD-2屬于第二類CAD基因。相對第一類CAD基因而言，第二和三類CAD基因在木質素生物合成中的作用并不突出，是第一類CAD基因的冗余基因（Kim et al.，2004）。因此，推測FtCAD-2基因在木質素合成方面作用不是很突出。多序列比對結果發現FtCAD-1和FtCAD-2雖然均含有3個CAD蛋白的典型保守結構域，但序列不完全一致。且FtCAD-1和FtCAD-2蛋白的三級結構也明顯不同，其中FtCAD-1與2cf5.1.B的結構相似度較高，而FtCAD-2與5z0c.1.A的結構相似度更高。由于蛋白結構決定其功能，證明二者功能存在明顯差異。因此本研究獲得的苦蕎FtCAD-1和FtCAD-2基因在薄果殼苦蕎木質素生物合成途徑的調控功能還需進一步驗證。

4 結論

FtCAD-1基因屬于第一類CAD基因，具有明顯的組織表達特異性，推測其在苦蕎木質素生物合成過程中發揮重要調控作用。

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（責任編輯 陳 燕）