點帶石斑魚腦組織和視網膜中神經型一氧化氮合成酶的分布與定位

白帆 孫敬鋒 張勝根 韓卓然 呂愛軍 胡秀彩

摘要：【目的】研究點帶石斑魚腦組織和視網膜中的一氧化氮（NO）含量及神經型一氧化氮合成酶（nNOS）分布與活性，為深入揭示NO在點帶石斑魚神經系統中的作用機制打下基礎?！痉椒ā坎捎肗ADPH-d組織化學染色法、免疫組織化學法、蛋白免疫印跡（Western blotting）及Griess試劑法，對點帶石斑魚腦組織和視網膜中nNOS的分布與活性及NO含量進行分析。【結果】經NADPH-d組織化學染色后，一氧化氮合成酶（NOS）陽性物質呈藍色。在點帶石斑魚大腦中，NOS陽性物質位于神經元和神經纖維;在小腦中，NOS分布在顆粒層的顆粒細胞、分子層的神經纖維和浦肯野細胞層的浦肯野細胞;在視網膜中，NOS分布于色素上皮層、視錐視桿層、外核層、外網層、內核層、內網層、節細胞層和視神經纖維層。經免疫組織化學染色后，nNOS陽性物質呈深棕色。在大腦中，nNOS存在于神經元和神經纖維;在小腦中，nNOS分布在顆粒層、分子層和浦肯野細胞層;在視網膜中，nNOS分布在色素上皮層、視錐視桿層、外核層、外網層、內核層、內網層、節細胞層和視神經纖維層。Western blotting檢測結果顯示，點帶石斑魚腦組織和視網膜中的nNOS在顯色后的硝酸纖維素膜上均出現3條免疫印跡條帶，對應分子量分別為80、120和130 kD。NO含量在點帶石斑魚腦組織和視網膜中分別為17.601±1.743和13.624±1.249 ?mol/L，nNOS活性在腦組織和視網膜中分別為38.070±3.047和23.748±2.860 U/mg?！窘Y論】在點帶石斑魚腦組織和視網膜中均存在nNOS，推測nNOS在點帶石斑魚腦神經及視神經系統生理活動中發揮重要作用。腦組織中的NO含量和nNOS活性均顯著高于視網膜，是由于腦組織作為重要的中樞神經，對機體生理功能起重要調節作用。

關鍵詞： 點帶石斑魚;神經型一氧化氮合成酶（nNOS）;腦組織;視網膜;免疫組織化學定位;NADPH-d組織化學染色

中圖分類號： S965.334? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3286-08

Immunohistochemical distribution and localization of neuronal nitric oxide synthase in brain and retina of Epinephelus coioides

BAI Fan， SUN Jing-feng*， ZHANG Sheng-gen， HAN Zhuo-ran， LYU Ai-jun， HU Xiu-cai

（College of Fisheries， Tianjin Agricultural University/Tianjin Key Lab of Aqua-ecology and

Aquaculture， Tianjin? 300384， China）

Abstract：【Objective】The content of nitric oxide（NO）， distribution and activity of neuronal nitric oxide synthase （nNOS） in brain and retina of Epinephelus coioides were studied to provide foundation for further revealing the mechanism of action of NO in the nervous system of E. coioides. 【Method】NADPH-d staining， immunohistochemical method， western blotting and Griess reaction were used to study the distribution， activity of nNOS and NO content in the brain and retina.【Result】The positive material of nitric oxide synthase（NOS） was stained blue using NADPH-d method. NOS positive materials were found in neurons and nerve fibers in the cerebrum. In the cerebellum， NOS was distributed in granular cells of the granular layer， nerve fibers of the molecular layer， and Purkinje cells of the Purkinje cell layer. In the retina， the NOS was found to be distributed in the pigment epithelium layer， rod and cone layer， outer nuclear layer， outer plexiform layer， inner nuclear layer， inner plexiform layer， ganglion cell layer and retinal nerve fiber layer. In addition， the immunohistochemical positive materials of nNOS were stained dark brown. In the cerebrum， nNOS was distributed in neurons and nerve fibers. In the cerebellum， nNOS was distributed in the granular layer， molecular layer and Purkinje cell layer. In the retina， nNOS was found to be distributed in the pigment epithelium layer， rod and cone layer， outer nuclear layer， outer plexiform layer， inner nuclear layer， inner plexiform layer， ganglion cell layer and retinal nerve fiber layer. The result of western blotting showed that there were three protein blotting bands on the nitrocellulose membrane after co-lor development for nNOS in the brain and retina， their corresponding molecular weights were 80， 120 and 130 kD， respectively. The NO content in brain and retina were 17.601±1.743 and 13.624±1.249 mol/L， respectively. The nNOS acti-vity in brain and retina were 38.070±3.047 and 23.748±2.860 U/mg， respectively. 【Conclusion】nNOS exists in brain and retina of E. coioides， and it is speculated that nNOS may play an important role in the cranial and visual nervous system physiological activity of fish. The NO content and nNOS activity in brain are significantly higher than those in retina， presumably because the brain is the important central nervous system and plays an important role in regulating the physiological functions of body.

Key words： Epinephelus coioides; neuronal nitric oxide synthase（nNOS）; brain; retina; immunohistochemistry; NADPH-d staining

Foundation item： National Natural Science Foundation of China （31972840）; Tianjin Natural Science Foundation （19JCZDJC34600）;? Scientific Research and Innovation Project of Tianjin Agricultural University （2019XY037）

0 引言

【研究意義】一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一種信使分子，具有多種生物學功能，能介導血管內皮源性舒張，并參與免疫調節和免疫耐受（Seabra and Duran，2017;Alimoradi et al.，2019;Yu et al.，2019）。NO是由L-精氨酸末端胍基氧化產生，此反應主要依靠一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthases，NOS）催化完成（Hedison et al.，2018）。根據組織表達及其功能的不同，可將NOS劃分為3種：神經型一氧化氮合成酶（Neuronal nitric oxide synthase，nNOS）、誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）和內皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）（Bogdan，2015）。其中，nNOS主要在腦神經系統的神經元中表達，通過神經轉運而引起血管和非血管平滑肌松弛，產生的NO參與大腦的發育、學習、擴展及記憶等過程（Luo and Zhu，2011;刁宏旺和李守林，2017;Chong et al.，2019）。因此，研究魚類nNOS的分布及活性，可為揭示NO在魚類神經系統中的作用機制提供理論依據?！厩叭搜芯窟M展】NO是神經元NMDA受體激活后產生的一種重要遞質，可促使神經系統第二信使cGMP的產生，從而對神經系統產生影響（Zhang et al.，2017）。視網膜是魚類產生視覺的部位，而NO是魚類視網膜中重要的神經調節因子，通過影響突觸前和突觸后的神經元以調節視覺信息處理（Neufeld et al.，2000;李超等，2014;Wang et al.，2018）。3種亞型NOS在視網膜中均有不同程度的表達，但nNOS是視覺反應的主要參與者（Vielma et al.，2012）。還原型輔酶Ⅱ依賴性黃遞酶（NADPH-d）作為NOS的組織化學標記物，可間接反映NO的分布及活性，已廣泛應用于NOS在神經系統中的定位研究，但NADPH-d組織化學染色無法直接區分NOS的3種亞型（Sun et al.，2020）。免疫組織化學法是通過抗原和抗體特異性結合區分不同亞型NOS（韓卓然等，2016），已有學者將這2種方法相結合用于神經系統中的nNOS定位研究。Sánchez-Islas和León-Olea（2001）通過分析nNOS在美西鈍口螈（Ambystoma mexicanum）嗅上皮中的分布情況，發現其主要存在于嗅覺受體神經元;王平利等（2011）研究發現恒河猴（Macaca mulatta）紋狀體中分布著大量的nNOS陽性神經元;Bombardi等（2013）研究證實nNOS在寬吻海豚（Tursiops truncatus）的脊髓中廣泛表達;Chong等（2019）研究報道了nNOS在嚙齒動物大腦不同區域的分布情況;López等（2019）通過研究澳大利亞肺魚（Neoceratodus forsteri）氮能系統，并以此評估神經遞質系統間的相互作用;Serenini等（2020）研究證實NO是肌腸神經細胞中重要的神經遞質之一，在平滑肌松弛過程中發揮中介作用;Yan等（2021）研究發現NOS在大鼠成牙本質細胞中有表達?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對nNOS的研究主要集中在哺乳動物（Anaeigoudari et al.，2016;Coelho et al.，2017;Zhang et al.，2018），僅在馬蘇大馬哈魚（Oncorhynchus masou）及大菱鲆（Scophthalmus maximus）等少數魚類中有報道（Pushchina et al.，2012;韓卓然等，2016），而有關點帶石斑魚（Epinephelus coioides）腦組織和視網膜中nNOS分布及活性與NO含量的研究至今鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用NADPH-d組織化學染色法、免疫組織化學法、蛋白免疫印跡（Western blotting）及Griess試劑法，對點帶石斑魚腦組織和視網膜中nNOS的分布與活性及NO含量進行研究，為深入揭示NO在點帶石斑魚神經系統中的作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試點帶石斑魚購自天津市海發珍品實業發展有限公司，平均體長20±1 cm、平均體重210±20 g;挑選健康無病的30尾點帶石斑魚備用。羊nNOS一抗（ab6175）和二抗（ab6746）購自英國Abcam公司;NO測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所;NOS測定試劑盒和蛋白定量測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1. 2 樣品采集與處理

點帶石斑魚以三卡因（MS-222）進行麻醉，體表消毒后于冰盤上取出腦組織和視網膜，放入4%多聚甲醛中固定5 h，然后置于20%蔗糖溶液中至組織沉底，-80 ℃保存備用。

1. 3 NADPH-d組織化學染色

使用冰凍切片機（Thermo Microm HM 525）進行快速冷凍切片;切片（厚度7 ?m）以PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗3次，每次5 min;然后在β-NADPH孵育液（0.3% Triton X-100，1 mg/mL NBT，0.6 mg/mL β-NADPH，0.1 mol/L PBS）中37 ℃孵育3 h，經脫水、透明及封片后進行鏡檢。陰性對照孵育液中不含β-NADPH。

1. 4 免疫組織化學定位

參照韓卓然等（2016）的方法進行免疫組織化學定位。在阻斷內源性過氧化物酶活性后進行抗原修復，具體操作：將冷凍切片置于枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）中煮沸15～20 min。以PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）代替一抗用于陰性對照。

1. 5 Western blotting檢測

將點帶石斑魚腦組織和視網膜樣品分別置于勻漿器中，加入單去污劑裂解液（0.05 mol/L Tris HCl，8.76 mg/mL NaCl，1% Triton X-100，100 μg/mL PMSF），在冰上進行充分勻漿后，參照孫敬鋒等（2017）的方法進行Western blotting檢測。

1. 6 NO含量與nNOS活性測定

取點帶石斑魚腦組織和視網膜樣品各100 mg，解凍后充分勻漿，分別采用蛋白定量測試盒（考馬斯亮藍法）測定蛋白含量，NO測定試劑盒（Griess試劑法）測定NO含量，NOS測定試劑盒（化學比濁法）測定nNOS活性，具體方法按試劑盒說明進行操作。

1. 7 統計分析

試驗數據采用SPSS 16.0中的獨立樣本 t 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 NADPH-d組織化學染色結果

經NADPH-d組織化學染色后，NOS陽性物質呈藍色。如圖1-A所示，點帶石斑魚大腦中存在豐富的神經元和神經纖維，神經元細胞核淡染，呈梭形或多角形，還有一些呈卵圓形。小腦顆粒層中的陽性顆粒細胞及分子層中的陽性神經纖維均呈藍色;浦肯野細胞中也存在NOS陽性反應（圖1-B）。在視網膜中，色素上皮層和視錐視桿層可觀察到大量藍色顆粒（圖1-C）;此外，在外核層、外網層和內核層（圖1-D），以及內網層、節細胞層和視神經纖維層均可觀察到NOS陽性物質（圖1-E）。

2. 2 免疫組織化學定位結果

經免疫組織化學染色后，nNOS陽性物質呈深棕色。在點帶石斑魚大腦中可觀察到神經元（圖2-A）和神經纖維（圖2-B）nNOS陽性物質;在小腦顆粒層中有少量nNOS陽性顆粒細胞，分子層中有許多的nNOS陽性神經纖維，浦肯野細胞也呈現nNOS陽性反應（圖2-C）。在視網膜中的色素上皮層、視錐視桿層、外核層和外網層（圖2-D），以及內核層、內網層、節細胞層和視神經纖維層均呈明顯的nNOS陽性反應（圖2-E）。

2. 3 Western blotting檢測結果

經Western blotting檢測，結果發現點帶石斑魚腦組織和視網膜中的nNOS分別在硝酸纖維素膜上出現3條免疫印跡條帶（圖3）。根據蛋白分子量標準Marker遷移率，計算得到對應的蛋白分子量分別為80、120和130 kD。

2. 4 NO含量及nNOS活性測定結果

由圖4可看出，點帶石斑魚腦組織中NO含量為17.601±1.743 ?mol/L，視網膜中NO含量為13.624±1.249 ?mol/L，即腦組織中的NO含量顯著高于視網膜（P<0.05，下同）。由圖5可看出，點帶石斑魚腦組織中nNOS活性為38.070±3.047 U/mg，視網膜中nNOS活性為23.748±2.860 U/mg，即腦組織中的nNOS活性顯著高于視網膜。

3 討論

NO是一種簡單的雙原子分子，參與體內信號轉導，在多種器官、系統和組織中發揮重要作用（Wang et al.，2018;Tejero et al.，2019）。NOS是NO合成過程中的關鍵酶，由于NO不穩定，因此主要通過觀察NOS分布及活性對NO進行定位研究（劉鵬等，2009;高川等，2020）。本研究采用NADPH-d組織化學染色法定位NOS，但無法直接鑒別NOS的亞型，故同時采用免疫組織化學法定位nNOS。nNOS結構域高度保守，在不同物種中均含有氧化蛋白域、還原蛋白域及鈣調素（CaM）結合位點等結構域（張湑澤等，2014）。nNOS的基因編碼區（CDS）高度保守，人類和鼠的nNOS氨基酸序列相似性為93%，鼠和牛的nNOS氨基酸序列相似性為98%（杜濱，2012）。經BLAST比對分析發現，羊nNOS抗體作為抗原肽的第1409～1429位氨基酸序列高度保守，故本研究以羊nNOS抗體檢測點帶石斑魚腦組織和視網膜中的nNOS分布情況。

經NADPH-d染色后，發現在點帶石斑魚大腦皮質的神經元和神經纖維及小腦皮質顆粒層、分子層和浦肯野細胞層中均存在NOS，與Schober等（1993）對虹鱒（Oncorhynchus mickiss）、Holmqvist等（1994）對大西洋鮭（Salmo salar）的研究結果相似。Villani和Guarnieri（1996）利用NADPH-d組織化學染色法對金魚（Carassius auratus）視網膜中的NOS進行定位，結果表明NOS主要分布在內核層、節細胞層、內網層和外網層。除此之外，本研究還在點帶石斑魚視網膜的色素上皮層、視錐視桿層、外核層和視神經纖維層中發現NOS陽性表達，造成這種差異的原因可能是魚的種類不同。鑒于NOS的3種亞型無法通過NADPH-d組織化學染色進行直接鑒別，本研究同時采用免疫組織化學法定位nNOS，結果發現nNOS位于點帶石斑魚大腦皮質的神經元和神經纖維及小腦皮質顆粒層、分子層和浦肯野細胞層中，與NADPH-d組織化學染色結果一致，且nNOS陽性神經元主要呈梭形，與Jadhao和Malz（2004）在伯氏妊麗魚（Haplochromis burtoni）腦組織中的觀察結果相似。已有研究證明，NO是視網膜中生理及病理過程的重要活性介質（Vielma et al.，2012）。經免疫組織化學染色后，在點帶石斑魚視網膜中深棕色的nNOS陽性物質主要分布在色素上皮層、視錐視桿層、外核層、外網層、內核層、內網層、節細胞層和視神經纖維層，與NADPH-d組織化學染色顯示的NOS分布部位一致，但NADPH-d組織化學染色的外核層、外網層、內核層、內網層、節細胞層和視神經纖維層顏色較弱，究其原因可能是NADPH-d組織化學染色定位的是NOS（包含3種NOS亞型），而免疫組織化學只定位nNOS。在點帶石斑魚的腦組織和視網膜中均存在nNOS，故推測nNOS產生的NO可作為神經遞質介導并參與神經系統的信息傳遞和生理調節過程。

Kim等（1999）采用Western blotting檢測NOS在大鼠、小鼠、豚鼠及兔子視網膜中的表達情況，結果均獲得1條分子量為155 kD的免疫印跡條帶。孫敬鋒等（2017）通過研究nNOS在毛蚶（Scapharca kagoshimensis）外套膜和鰓組織中的表達情況，發現有2條nNOS免疫反應條帶，對應的分子量分別為120和80 kD。本研究利用Western blotting對點帶石斑魚腦組織和視網膜中的nNOS進行檢測分析，結果獲得3條免疫印跡條帶，對應的蛋白分子量分別為80、120和130 kD。nNOS在進化過程中高度保守，在不同物種的不同組織器官中均有分布，但其蛋白分子量存在差異。在點帶石斑魚腦組織和視網膜中均出現3條不同分子量的nNOS免疫印跡條帶，究其原因可能是nNOS存在不同的修飾和剪接作用下并非以單一形式存在，但具體作用機制還需進一步探究。

NO含量變化在機體生理機能中發揮重要作用，免疫調節、血小板凝集反應及神經信號傳遞等生理過程均伴隨有低水平的NO，而許多疾病的產生和發展與機體體內穩定的NO含量變化有關（張勝根等，2011;Akanji et al.，2020）。在正常生理狀況下，nNOS可在組織器官內低水平表達（Robbins and Grisham，1997）。張勝根等（2011）研究表明，在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Gunther）不同組織器官中均能檢測到NO和NOS，但不同組織器官中的NO含量和NOS活性存在明顯差異。本研究結果顯示，點帶石斑魚腦組織中的NO含量和nNOS活性均顯著高于視網膜，推測腦組織作為重要的中樞神經，含有豐富的nNOS，產生的NO可調節機體的生理功能。

4 結論

在點帶石斑魚腦組織和視網膜中均存在nNOS，推測nNOS在點帶石斑魚腦神經及視神經系統生理活動中發揮重要作用。腦組織中的NO含量和nNOS活性均顯著高于視網膜，是由于腦組織作為重要的中樞神經，對機體生理功能起重要調節作用。

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（責任編輯 陳德元）