澳洲堅果MiSTPP6基因克隆及低溫脅迫下表達分析

蔡元保 楊祥燕 李季東 黃思婕 李穆 巫輔民

蔡元保（1981-），高級農藝師，主要從事果樹分子生物學與遺傳育種研究工作，主持國家自然科學基金項目、廣西重點研發計劃項目和廣西自然科學基金等科研項目4項，并作為主要成員參與農業農村部行業科技專項、廣西創新驅動發展專項等重大科研項目。以第一完成人或主要完成人獲得省部級科技獎2項，地廳級科技獎4項;以第一發明人或第一完成人獲得國家專利授權18項（其中發明專利6項）和計算機軟件著作權登記6項。主持或主要參與廣西地方標準2項，作物新品種登記5個;以第一作者或通訊作者在《南方農業學報》《植物學報》《植物生理學報》《植物遺傳資源學報》等期刊上發表論文30多篇，并獲得優秀論文13篇。

摘要：【目的】克隆澳洲堅果絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6），并分析其不同組織及低溫脅迫下的表達模式，為澳洲堅果PP1家族基因的抗寒分子機制提供理論依據?！痉椒ā炕诎闹迗怨D錄組測序結果，利用RT-PCR技術克隆MiSTPP6基因，對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR檢測其在不同組織及低溫脅迫下的表達情況?！窘Y果】從澳洲堅果中克隆獲得MiSTPP6基因（GenBank登錄號為MT374553），其cDNA全長2129 bp，最大的閱讀框（ORF）長度為948 bp，編碼315個氨基酸殘基，含有PP1蛋白家族的典型結構域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白為穩定的親水性蛋白，以絲氨酸磷酸化為主，可能定位于細胞質，屬于非分泌型蛋白或膜蛋白，與已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二級結構由α-螺旋（占40.00%）、無規則卷曲（占32.38%）、延伸鏈（占18.41%）和β-轉角（占9.21%），其三級結構與模板蛋白4v0u.1.A的結構相似度為80.60%，GMQE值為0.89。MiSTPP6基因在根、莖、葉、剛開放的小花和謝花后30～45 d的小果中均有表達，其中，MiSTPP6基因在剛開放的小花中的相對表達量最高。4 ℃低溫脅迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲堅果苗期葉片中的相對表達量較對照明顯下調，整體上呈持續下降的趨勢。【結論】MiSTPP6屬于PP1家族基因，具有組織表達特異性，可能在澳洲堅果抗寒分子機制中發揮重要的調控作用。

關鍵詞： 澳洲堅果;蛋白磷酸酶;PP1;基因克隆;表達分析;低溫脅迫

中圖分類號： S664.903.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3205-07

Cloning and expression analysis of MiSTPP6 gene from Macadamia integrifolia under cold stress

CAI Yuan-bao， YANG Xiang-yan*， LI Ji-dong， HUANG Si-jie， LI Mu， WU Fu-min

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To clone serine/thonine protein phosphatase（PP1） family gene MiSTPP6 from macadamia （Macadamia integrifolia） and analyze its expression patterns in different tissues and cold stress，so as to provide scientific basis for the molecular mechanism of PPI family gene in response to cold stress. 【Method】Based on the transcriptome sequencing of macadamia， MiSTPP6 gene was cloned by RT-PCR and its sequences were analyzed by bioinformatics，and its expression in different tissues and cold stress was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Result】A new protein phosphatase gene MiSTPP6 was cloned from M. integrifolia （GenBank accession number was MT374553）. The full length cDNA and open reading frame （ORF） were 2129 bp and 948 bp，encoding 315 amino acidswith MPP_PP1_ PPKL domain and signature sequence （LRGNHE） belonged to the PP1 protein family. MiSTPP6 was a stable hydrophilic protein and mainly phosphorylated by serine，which might be located in the cytoplasm. MiSTPP6 was non-secreted transmembrane protein，which had high similarity with the amino acid sequence of known plant PP1 proteins. The secondary structure of MiSTPP6 consisted of α-helix （40.00%），random coil （32.38%），extended strand （18.41%） and β-turn （9.21%）.The similarity of tertiary structure between MiSTPP6 and the template protein 4v0u.1.A was 80.60%，and the GMQE value was 0.89. MiSTPP6 was expressed in different tissues （roots，stems，leaves，small flowers and small fruits 30-45 d after blossom falling） of macadamia，with the highest expression in opened flower. After low temperature （4 ℃） stress for 0.5-24.0 h，the relative expression of MiSTPP6 in macadamia seedling leaves was significantly down-regulated compared with the control，and the overall trend continued to decrease. 【Conclusion】MiSTPP6 belongs to PP1 family gene and has tissue expression specificity， it may play an important regulatory role in the molecular mechanism of response to cold stress in macadamia.

Key words： macadamia; protein phosphatase; PP1; gene cloning; expression analysis; cold stress

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860537）;Guangxi Science and Technology Planning Project（GuikeAB19245008）;Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT154，Guinongke 2020YM56）

0 引言

【研究意義】蛋白磷酸酶是蛋白質可逆磷酸化過程中的兩個關鍵酶之一，通過蛋白質去磷酸化修飾，從而改變目標蛋白的構象、生物學活性和穩定性（Tang et al.，2011;Miura et al.，2011;Casamayor and Ari?o，2020），因此，蛋白磷酸酶在植物新陳代謝、光合作用、信號轉導、生長發育、蛋白質合成、細胞凋亡等生理生化過程中發揮重要的調控作用，尤其是與植物抗逆性密切相關（翁華等，2003;Ceulemans and Bollen，2004;Shi，2009）。澳洲堅果（Macadamia spp.）原產于亞熱帶雨林，被譽為“干果皇后”，其生長環境要求較高，其中氣溫是主要影響因素之一，若氣溫高于30 ℃或低于10 ℃均會嚴重影響其正常生長（Buthelezi et al.，2019;Herbert et al.，2019）。因此，研究澳洲堅果蛋白磷酸酶的功能對于揭示澳洲堅果的抗寒分子機制具有重要指導意義?！厩叭搜芯窟M展】蛋白激酶和蛋白磷酸酶的理化性質互為對立，在參與蛋白質的可逆磷酸化過程中，蛋白激酶催化蛋白的磷酸化反應，而蛋白磷酸酶催化去磷酸化反應（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班軍等，2014）。其中，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PPs）根據底物的特異性、金屬離子的依賴性及其抑制劑的敏感性，可分為PP1和PP2家族（Luan，2003;Verbinnen et al.，2017）。目前，PP2基因家族的生物學功能及其調控機制研究較多，尤其是PP2A和PP2C亞家族。其中，PP2A基因在調控植物逆境脅迫中發揮重要作用，如PP2A作為關鍵調控基因可響應逆境脅迫（Khan et al.，2020），也可作為水楊酸靶基因抑制植物生長（Tan et al.，2020），還可調控植物的氧化應激信號轉導（Máthé et al.，2019）;PP2C基因在植物脫落酸信號轉導（Jung et al.，2020）和響應干旱脅迫和鹽脅迫中發揮重要的調控作用（Krzywińska et al.，2016;Baek et al.，2019）。PP1家族蛋白是蛋白磷酸酶的一個重要分支，該家族蛋白的組成、結構、理化性質均與其他家族成員顯著不同，但均在細胞信號傳遞過程中發揮重要作用。PP1家族蛋白的活性主要受內源抑制劑I-1和I-2的抑制，且主要作用于磷酸酶激酶的β亞基（Farkas et al.，2007）。目前，在豌豆（Guo and Roux，1996）、小麥（Vazquez-Tello et al.，1998）、水稻（Liao et al.，2016）、辣椒（Baek et al.，2017）和擬南芥（Zhang et al.，2020）等多種植物基因組DNA中已分離出PP1家族基因，且發現其在植物響應逆境脅迫中發揮重要調控作用。目前有關PP1家族基因在響應逆境脅迫的分子機制尚不清楚，有待進一步研究。【本研究切入點】目前有關澳洲堅果PP1家族基因克隆及功能分析的相關研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】基于課題組前期的研究結果（蔡元保等，2013），從澳洲堅果中克隆PP1家族基因（MiSTPP6），對其序列進行生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR檢測其在不同組織及低溫脅迫下的表達情況，以期為澳洲堅果蛋白磷酸酶基因的抗寒分子機制及抗寒品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試品種為澳洲堅果（M. integrifolia）品種Own Choice（縮寫為O.C.），取自廣西亞熱帶作物研究所澳洲堅果種質圃。主要試劑：高保真酶Primer STAR Max DNA Polymerase、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker和pMD18-T等購自寶生物工程（大連）有限公司;M-MLV反轉錄試劑盒購自美國Life公司;ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾維贊生物科技有限公司。主要儀器設備：CFX96 Real-Time PCR System熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）。

1. 2 樣品處理及采集

收集O.C.嫁接苗（接穗為4個月苗齡）的根、莖和葉及剛開放的小花和謝花后30～45 d的小果。對O.C.幼苗進行4 ℃低溫脅迫，分別處理0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h，對照組（CK）為未低溫處理，試驗重復3次，并收集這些葉片樣品。

1. 3 總RNA提取及cDNA合成

取液氮速凍后的澳洲堅果樣品，采用優化的CTAB改良法進行總RNA提?。ú淘５?，2014）。總RNA的濃度和純度用核酸蛋白分析儀進行檢測，其完整性利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。以澳洲堅果樣品總RNA為模板，參照M-MLV反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA第一鏈。

1. 4 MiSTPP6基因cDNA克隆

本課題組通過澳洲堅果抗寒轉錄組測序分析，篩選獲得1個PP1家族基因序列，采用ORFfinder查找最大的開放閱讀框（ORF），采用Primer Premier 5.0設計ORF兩端引物（STPP6-F和STPP6-R）（表1），由深圳華大基因研究院合成。以澳洲堅果葉片cDNA為模板、STPP6-F和STPP6-R引物為引物進行PCR擴增。反應體系：2×Primer STAR Max 12.0 μL，10 μmol/L 正、反向引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，無菌ddH2O補充至25.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min;94 ℃ 35 s，58.3 ℃ 40 s，72 ℃ 75 s，進行34個循環;72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。利用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，并將目標條帶連接至pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在含有氨芐青霉素的固體培養基中挑取陽性克隆，送至深圳華大基因研究院進行測序。

1. 5 生物信息學分析

利用NCBI數據庫的BLASTp對克隆基因編碼的氨基酸序列進行同源比對分析，并用ORFfinder進行最大的ORF預測。采用SMART和PROSITE預測編碼蛋白的功能結構域和功能基元;利用ProtParam預測蛋白的理化性質;通過NetPhos 3.1分析蛋白的磷酸化位點;以PSORT分析蛋白的亞細胞定位;利用SignalP 4.1預測蛋白的信號肽;采用TMpred預測蛋白的跨膜結構域;通過SOPMA和SWISS-MODEL進行蛋白的二、三級結構預測。在NCBI數據庫的GenBank中搜索同源蛋白，利用DNAMAN 6.0進行蛋白的氨基酸序列多重比對分析，并用MEGA 5.1的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構建系統發育進化樹（Bootstrap為1000次重復）。

1. 6 澳洲堅果MiSTPP6基因的表達模式分析

采用Primer Premier 5.0設計MiSTPP6基因的熒光定量引物QSTPP6-F和QSTPP6-R（表1）。利用BioRad CFX96熒光定量PCR檢測MiSTPP6基因在澳洲堅果不同組織及低溫脅迫下的表達情況，以澳洲堅果管家基因MADH為內參基因（楊倩等，2020）。反應體系：2×SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，無菌ddH2O補充至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃15 s，60.8 ℃或58.0 ℃（表1）25 s，72 ℃ 30 s，進行42個循環。每個試驗重復3次。

1. 7 統計分析

采用Excel 2016進行數據處理和作圖，采用2-ΔΔCt方法計算MiSTPP6基因的相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結果與分析

2. 1 MiSTPP6基因克隆結果

以澳洲堅果葉片cDNA為模板、STPP6-F和STPP6-R為引物進行PCR擴增。擴增片段測序結果和同源序列分析結果顯示，該片段全長2129 bp，ORF長度為948 bp，編碼315個氨基酸殘基，與其他植物的PP1基因家族成員具有極高的相似性，說明擴增片段為PP1家族基因，將其命名為MiSTPP6，GenBank登錄號為MT374553。

2. 2 MiSTPP6與其他植物PP1蛋白的序列比對結果

對MiSTPP6與其他植物PP1蛋白的氨基酸序列進行多重比對分析，結果表明MiSTPP6蛋白與已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性（圖1），其中，與罌粟（Papaver somniferum）PsPP1-1蛋白（XP_026418403）高達92.70%，與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）PePP1-1（XP_020590163）高達90.10%，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）DcPP1-1（XP_020673587）高達89.17%，與藜麥（Chenopodium quinoa）CqPP1（XP_021769065）高達88.50%。功能結構域預測分析結果顯示，MiSTPP6含有PP1蛋白家族的典型結構域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。

2. 3 MiSTPP6與其他PPs的系統進化分析結果

從GenBank中選擇來源于不同植物的代表性PPs蛋白構建系統發育進化樹，結果（圖2）表明，20個PPs蛋白被分成PP1和PP2家族，其中，MiSTPP6屬于PP1家族，與罌粟PsPP1-1（XP_026418403）、姬蝴蝶蘭PePP1-1（XP_020590163）和鐵皮石斛DcPP1-1（XP_020673587）的親緣關系最近。

2. 4 MiSTPP6蛋白的理化特性分析結果

MiSTPP6蛋白分子式C1599H2502N426O464S19，分子量35.73 kD，理論等電點（pI）5.18，負電荷殘基（Asp+Glu）和正電荷殘基（Arg+Lys）分別為43和34個，不穩定指數Ⅱ37.48，脂肪系數95.65，親水性系數-0.105，說明該蛋白為穩定的親水性蛋白。

2. 5 MiSTPP6蛋白的磷酸化位點、亞細胞定位、跨膜域和信號肽預測結果

NetPhos 3.1分析結果（圖3）顯示，MiSTPP6蛋白的磷酸化位點高（分值大于0.5）的氨基酸有20個，其中絲氨酸10個，蘇氨酸6個，酪氨酸4個，且這些磷酸化位點在該蛋白中的分布不均勻。PSORT預測結果表明，MiSTPP6蛋白定位于細胞質的概率較高，為65%。TMpred和SignalP預測結果顯示，MiSTPP6蛋白不含跨膜域和信號肽序列，屬于非分泌型蛋白或膜蛋白。

2. 6 MiSTPP6蛋白的二、三級結構預測結果

SOPMA預測結果可知，MiSTPP6蛋白二級結構由α-螺旋（占40.00%）、無規則卷曲（占32.38%）、延伸鏈（占18.41%）和β-轉角（占9.21%）（圖4）。以PP1（4v0u.1.A）為同源模板對MiSTPP6蛋白進行建模，結果（圖5）顯示，MiSTPP6蛋白與模板蛋白4v0u.1.A的結構相似度為80.60%，GMQE值為0.89，主要由α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈組成，與二級結構預測結果基本一致。

2. 7 MiSTPP6基因的表達分析結果

由圖6可知，MiSTPP6基因在澳洲堅果的根、莖、葉、小花和小果中均有表達，其中MiSTPP6基因在剛開放的小花中的相對表達量最高，其次是小果，在莖中的相對表達量最低。由圖7可知，4 ℃低溫脅迫后0.5～24.0 h，MiSTPP6基因在澳洲堅果苗期葉片中的相對表達量較對照明顯下調，整體上呈持續下降的趨勢。

3 討論

PP1由催化亞基和調節亞基組成的全酶。研究發現，動物基因組編碼大約200個相互作用的PP1蛋白。但在植物中僅有少數PP1蛋白被報道（Zhang et al.，2020）。PP1家族蛋白的氨基酸序列及蛋白空間結構高度保守，含有典型的MPP_PP1_PPKL結構域（Casamayor and Ari?o，2020）。本研究從澳洲堅果克隆獲得MiSTPP6基因，其編碼的氨基酸序列含有PP1蛋白家族的典型結構域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE），且與其他已鑒定的PP1蛋白具有極高的氨基酸序列相似性，并被聚類到PP1蛋白家族，推測MiSTPP6是PP1蛋白家族的新成員。由于PP1蛋白和其他家族的PPs一樣，均是通過蛋白質去磷酸化修飾，在細胞信號轉導、生長發育、新陳代謝等生命活動發揮重要作用（Kostich et al.，2002;Shi，2009）。MiSTPP6是穩定的親水性蛋白，以絲氨酸磷酸化為主。根據氨基酸磷酸化修飾的作用（Barrero-Gil and Salinas，2013;阮班軍等，2014），推測MiSTPP6蛋白可通過絲氨酸磷酸化修飾發揮重要的生物學功能。

已有研究表明，PP1家族基因在植物不同組織中廣泛表達，其編碼蛋白可定位于細胞的不同部位，以便于行使其生物學功能（Verbinnen et al.，2017）。如擬南芥PP1R3基因在不同組織中廣泛表達，其編碼蛋白又與Ⅰ型蛋白磷酸酶（TOPPs）共定位于細胞核和細胞質中（Zhang et al.，2020）。本研究發現，MiSTPP6基因在澳洲堅果的根、莖、葉、小花和小果等不同組織中均有表達，且其編碼蛋白很可能定位于細胞質，故推測澳洲堅果MiSTPP6在細胞質中調控細胞的生長發育。

PP1家族基因在植物響應脫落酸（ABA）、干旱脅迫、鹽脅迫等逆境脅迫中發揮重要的調控作用，如OsPP1a基因超表達可增強轉基因水稻的耐鹽性（Liao et al.，2016）;辣椒CaAIPP1與CaAIRF1互作以調控ABA信號和干旱脅迫響應（Baek et al.，2017）;擬南芥PP1R3介導ABA反應（Zhang et al.，2020）。本研究發現，澳洲堅果幼苗受4 ℃低溫脅迫后，MiSTPP6基因的相對表達量整體上呈持續下降的趨勢，因此，推測MiSTPP6可能作為負調控因子在澳洲堅果抗寒分子機制中發揮作用。由于MiSTPP6基因在其他逆境脅迫中的功能研究尚無報道。在后續研究中，應通過亞細胞定位、過量或反義表達等對MiSTPP6基因功能進行深入研究，對于了解蛋白質可逆磷酸化過程及其在澳洲堅果抗逆境脅迫的作用機制具有重要意義。

4 結論

MiSTPP6屬于PP1家族基因，具有組織表達特異性，可能在澳洲堅果抗寒分子機制中發揮重要的調控作用。

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（責任編輯 陳 燕）