Siva-1在胃癌組織中的表達及其臨床意義*

孔凡彪，鄧洪強，徐勝，王曉通，麥威，龐黎明

（廣西壯族自治區人民醫院1.結直腸肛門外科，2.胃腸疝腸瘺外科，廣西 南寧530023）

胃癌是我國常見的消化道腫瘤之一，每年新發病例約41 萬[1]，嚴重威脅我國人民的生命健康。隨著分子生物學研究的深入，分子靶點及分子標志物的相關研究逐漸成為腫瘤研究的熱點。凋亡誘導因子Siva-1 已被證實在多種腫瘤中發揮抑制腫瘤細胞生長的功能[2-4]，而其與胃癌相關的報道甚少。因此中筆者通過分析Siva-1 在胃癌組織中的表達，為探討Siva-1 在胃癌發生、發展中的作用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年12月廣西壯族自治區人民醫院經手術切除的胃癌組織及癌旁組織各54例。其中，男性37例，女性17例；年齡24～76 歲，中位年齡60 歲。胃癌臨床分期參照美國腫瘤聯合委員會（AJCC）第7 版指南標準[5]，患者均未接受術前放療、化療。鼠抗人Siva-1 抗體購于美國Proteintech 公司，免疫組織化學試劑盒購自福州邁新技術開發有限生物公司。Trizol 試劑、引物及PCR 試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測Siva-1 表達采用SP 法檢測Siva-1 的表達。將石蠟標本進行包埋并連續切片，每片厚度約4 μm，利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，酒精脫水，3%雙氧水滅活，并在枸櫞酸鈉緩沖液中進行抗原修復。然后根據SP 法對石蠟標本進行一抗（鼠抗人Siva-1 抗體）、二抗孵育，染色后在光鏡下觀察計數。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 Siva-1陽性結果判斷Siva-1 蛋白主要表達于胃癌細胞質中，當細胞質里出現棕黃色或棕褐色顆粒，即說明Siva-1 在該細胞中陽性表達。采用雙盲法在顯微鏡下對染色的細胞進行觀察和計數。根據細胞的染色程度進行評分：未染色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。另根據染色細胞占視野細胞總數的百分比進行評分，陽性細胞＜1%計0 分，1%～＜25%計1 分，25%～＜50%計2 分，50%～＜75%計3 分，75%～100%計4 分。陽性細胞強度得分與陽性細胞百分比得分的乘積即為SP法總分，其中0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8 分為中陽性，9 分以上為強陽性。本實驗將中陽性以上定義為細胞染色陽性表達。

1.2.3 qRT-PCR采用qRT-PCR 檢測胃癌及癌旁組織中Siva-1 mRNA 相對表達量。在液氮中研磨組織，按Trizol 說明書提取組織總RNA 后，利用Thermo BioMate 3S 紫外/可見光分光光度儀測定RNA純度（OD 值）和蛋白質濃度。OD260/OD280 范圍為1.8～2.1。按qRT-PCR 試劑盒說明書進行逆轉錄，得到cDNA。反應參數為：16℃、30 min，42℃、30 min，90℃、5 min。反應結束后短暫離心，置于冰上冷卻。然后進行RT-PCR擴增反應，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，70℃延伸30 s，共40 個循環。PCR 引物設計合成由上海吉凱基因公司完成（見表1）。采用2-△△ct法測定目標基因mRNA相對表達量，用Data Assist（V3.01）軟件進行結果分析。

表1 PCR引物序列

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗，相關性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌及癌旁組織中Siva-1的陽性表達

Siva-1 在胃癌組織中的陽性表達率為25.93%（14/54），癌旁組織為94.44%（51/54），經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=52.900，P=0.000），胃癌組織中Siva-1 的陽性表達低于癌旁組織。見圖1。

圖1 Siva-1蛋白在各組織中的表達 （免疫組織化學法×400）

2.2 胃癌組織與癌旁組織中Siva-1 mRNA 表達水平

Siva-1 mRNA 在胃癌組織中相對表達量為（6.97±1.32），癌旁組織為（78.06±2.98），經t檢驗，差異有統計學意義（t=-362.450，P=0.000），Siva-1 mRNA 在胃癌組織中低表達。

2.3 不同臨床病理特征胃癌患者Siva-1陽性表達率比較

不同年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴轉移、神經侵犯、脈管內癌栓患者Siva-1 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、腫瘤分期患者Siva-1 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征的胃癌患者Siva-1陽性表達率比較 例（%）

2.4 Siva-1表達水平與腫瘤直徑的相關性分析

經Pearson 相關性分析，Siva-1 mRNA 相對表達量與腫瘤直徑呈負相關（r=-0.376，P=0.003）。

3 討論

凋亡誘導因子Siva-1 定位在染色體14q（32-33）上，含有175 個氨基酸，在正常組織中均有表達。有研究表明Siva-1 在乳腺癌和結直腸癌中的表達水平均低于癌旁正常組織，與本研究結果一致[6-8]，說明Siva-1 作為凋亡因子，可能在腫瘤中扮演著促進癌細胞凋亡的作用，提示Siva-1在胃癌的發生、發展過程中起著抑制作用，是一個抑癌基因。

本研究發現Siva-1 陽性表達率在不同年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴轉移、神經侵犯脈管內癌栓患者無差異，在不同腫瘤直徑及腫瘤分期患者有差異；且Siva-1 mRNA 相對表達量與腫瘤直徑呈負相關。即腫瘤直徑越大，mRNA 相對表達量越低。提示Siva-1 存在作為胃癌臨床病理分期標志物的可能。但Siva-1 mRNA 相對表達量可能與胃癌細胞的侵犯能力無關。

細胞凋亡遵循自身的程序，凋亡的調節對維持體內環境穩態及正常細胞形態至關重要，腫瘤的發生一方面由于腫瘤的過度增生，另一方面是由于細胞凋亡受阻。凋亡過程發生異常也可造成腫瘤增生[9]。近年來，細胞凋亡已成為生物醫學的研究熱點之一。本研究結果顯示：相比癌旁組織，胃癌組織中Siva-1 陽性表達率降低，其促凋亡作用減弱，導致腫瘤細胞異常增生，表現為腫瘤體積增大，腫瘤分期級別增高。Siva-1 在體內外均能與抑癌基因讀碼框移位蛋白發生直接作用，促進抑癌基因讀碼框移位蛋白的泛素化或降解，從而影響P53 的穩定性，進而調節細胞周期進程和細胞增殖[10]。Siva-1 還可與多種受體結合，通過其N 末端與CD27、Bcl-2 或Bcl-xl 的C 末端相結合而發生相互作用，從而調控多條信號通路并促進細胞凋亡，在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤細胞中，具有抑制腫瘤細胞生長及轉移的作用[7]，同時還可以作為化療藥順鉑的增效劑，為腫瘤的靶向治療提供新的思路[8-10]。通過慢病毒干擾人為下調Siva-1 的表達后，胃癌細胞的增殖活性增強，并且胃癌細胞的對化療藥DDP 的耐藥性也得以提高，與本課題組前期體外實驗結果一致[13-15]。Siva-1 陽性表達率在有無淋巴結轉移患者中無差異，說明Siva-1 陽性表達率與腫瘤的轉移關系不密切，主要是與腫瘤凋亡關系相關，可作為臨床分期標志物。

綜上所述，本研究提示Siva-1 的表達可能與胃癌細胞個體的生長及凋亡相關，而與細胞侵襲運動無關，其具體機制尚需進一步探索，但隨著對Siva-1 分子機制的深入研究，其作為潛在的靶向治療靶點的應用前景非常廣泛，尤其是其作為化療藥的增效劑將為腫瘤治療提供新的思路。