間充質干細胞胞外囊泡的研究及應用進展*

郭春，葉小康

（浙江大學醫學院1.公共技術平臺，2.基礎醫學系，浙江 杭州310012）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，因其獨特的分化潛能、造血支持和免疫調控等特性，MSC 已作為一種細胞治療手段被廣泛的應用于多種疾病。最初，MSC 被認為可巢居到受損部位后，通過定向分化成靶細胞和直接的細胞間相互作用來發揮功能[1]。然而，有研究表明MSC 巢居到損傷部位的比例和分化為靶細胞的數量都是非常有限，且移植后產生治療效應的時間與其所需的漫長的遷移分化時間不符，后續研究表明MSC通過旁分泌攜帶活性的蛋白質、細胞因子和核酸類物質的細胞外囊泡（EVs）方式發揮對器官的修復、保護及治療功能[2]。盡管極具應用潛力，但由于對MSC-EVs 的研究尚在摸索階段，且缺乏靈敏的EVs 制備和分析技術，所以在臨床轉化上仍有障礙。

1 EVs的分類命名及分子組成

EVs 由細胞主動釋放到細胞外環境中的納米級膜性囊泡，根據EVs 大小和來源的不同將其大致分為3 類：①凋亡小體800～5000 nm，在細胞發生凋亡時從細胞脫落而產生；②微囊泡（MVs）200～1 000 nm，由質膜以直接出牙的方式產生，MVs 產生過程與胞質內鈣離子濃度的增加和細胞膜骨架的重構有關；③外泌體（Exos）30～150 nm，由多囊體分泌，主要通過胞吐過程釋放，與細胞骨架的激活和鈣離子濃度相關[3]。

EVs 富含脂類、胞漿蛋白、核酸等物質，且其蛋白組成在一定程度上可以指示生物來源和分類[4]。MSC-EVs 有著與其他細胞EVs 相似的內容物，如TSPAN 蛋白超家族CD63、CD9、CD81 和熱休克蛋白HSP70、HSP90 等，這些是分析鑒定EVs的重要標志物。此外，MSC-EVs 還有其特異的標志物及獨特的內容物：一方面MSC-EVs 可表達其母細胞表面特異性分子如CD44、CD90 等[5]；另一方面MSC-EVs 富含與其修復再生功能密切相關的miRNA、白細胞介素、核因子κB 信號通路及多種生長因子，這些獨特的物質使其在維持組織穩態和平衡中扮演著重要的角色[6]。如在一項急性腎損傷模型研究中發現，MSC-EVs 可以降低CX3C 趨化因子配體1 的表達，減少巨噬細胞浸潤，進一步的研究顯示MSC-EVs 中所含與CX3C 趨化因子配體1相關的miRNA 發揮了抗炎作用[7]。

2 EVs分離方法

EVs 在大小、起源及分子組成上都存在較大的異質性，此外，其還存在于不同的復雜生物液體中。因此，EVs 的分離和純化被認為是生物醫學研究和臨床轉化的必要前提。

差超速離心法是目前EVs 分離中應用最廣泛的方法，此方法獲得的EVs 量多，但純度不足。為了進一步改善超速離心法分離的純度，研究者提出了基于梯度介質的密度梯度離心法，該法較差速離心法提得的EVs 純度更純，但是操作更為繁瑣，離心耗時也更長。最近，基于聚合物共沉淀技術的商品化試劑盒也被廣泛用于EVs 分離。但其缺點在于這樣分離到的EVs 可能會受到聚合物和一些蛋白質的污染，從而對后續的功能性分析產生影響。免疫親和法是將磷脂酰絲氨酸與磁珠結合，利用親和原理捕獲EVs 的磷脂酰絲氨酸。該方法獲得的EVs 形態完整，純度最高。不過該法成本較高，不適合從大樣本中提取EVs，使用該方法前需多樣本進行濃縮。

此外，還有一些隨著納米技術發展而興起的新型富集方法。基于微流控技術的分離檢測具有所需樣本小、檢測速度快及純度高等優點，因此研究人員在微流控技術的基礎上結合聲波[8]、介電電泳、微流體黏彈性[9]等特性成功發展了多種新穎EVs 分離方法，但微流控技術仍然存在通量低，回收量少的缺點。流式分選法基于流式分析和分選技術，可實現單顆粒、多參數及高通量分選，但需先對EVs 進行特異性熒光抗體標記。此外還需高精度的納米流式儀器、專業的技術調試，故應用受到一定限制。

綜上所述，經濟實惠、特異高效的方法就目前而言似乎不存在，但是未來卻有無限可能。就目前來看，將多種分離方法聯合使用就是不錯的選擇。DAVIES 等[10]結合微流體和過濾2 種方法，將納米多孔膜整合到微流控芯片上，形成微流控過濾系統。相對于常規的過濾方法，這種裝置可以通過改變致孔溶劑與預聚物溶液的比例控制納米孔的尺寸，使其適合于外泌體的提取和分離。并且此方法采用電泳驅動過濾，消除了一些可溶性蛋白的干擾，從而提高了純度。另外值得注意的是，牛血清白蛋白因本身含有一定功能效應的囊泡，會對MSC-EVs 蛋白的定量和定性檢測造成干擾，并直接影響下游功能驗證，建議整個分離過程不要使用[11]。

3 EVs鑒定方法

目前對EVs 的鑒定主要從其物理特征和表面特異性標志物兩方面進行。顯微鏡觀察法已被廣泛應用于EVs 表征分析，包括掃描電子顯微鏡技術（SEM）、透射電子顯微鏡技術（TEM）及冷凍電子顯微鏡技術（Cryo-SEM）等。SEM 是在真空條件下進行，因固定和干燥使EVs 在鏡下成扭曲的杯狀梭型。TEM 較SEM 具有更高的分辨率，且還能與免疫金標技術聯合使用進行EVs 分子分析鑒定，得到其表面特征分子的信息[12]。Cryo-SEM 是一種在極低溫度環境下進行樣本分析的電鏡技術，其的最大優勢在于避免了固定和干燥處理對EVs 物理形態和化學特性的影響。此外，原子力顯微鏡技術也可用于EVs 的表面結構及性質分析[13]。納米粒子跟蹤分析技術是表征EVs 大小及分布的另一常用方法。其原理是基于光散射和布朗運動的性質，可實現對50～1000 nm 直徑范圍內特定的EVs 和MVs逐個直接成像和觀察，得到與之相關的高分辨率的粒度分布和濃度信息。同樣基于布朗運動的還有動態光散射技術，但該技術是對EVs 進行整體分析，而非逐一單個的分析。上述方法均有樣本量小、快速、易用等優點。但存在通量低，不能同時獲得多參數信息、無法區分粒徑相同的蛋白聚集體等局限。因此，需聯合使用其他“定性”技術以獲得更為準確的結論。

傳統的EVs 定性方法主要有Western blotting 和ELISA，其可對細胞外囊泡中總蛋白表達量及特異性標志物進行分析。但因所需樣本量大、耗時、操作過程繁瑣等缺點，在EVs 臨床研究中并不適用，對一些低表達或稀有樣本的EVs 分析尤其不適用。流式細胞術因其高通量、多參數、單顆粒的特性贏得了越來越多研究者青睞。雖然EVs 的亞微米直徑、非均質性特點讓流式檢測EVs 依然面臨諸多挑戰[14]，但隨著高敏感性納米流式儀的推出，設備本身的分辨率和敏感性將不會成為流式分析EVs的瓶頸，目前困擾流式技術分析外泌體的問題主要集中在樣品的前處理、流式方法的標準化及EVs標志物尋找。MSC-EVs 因同時表達MSCs 表面特異性的分子，可作為特異性標志物鑒定的依據。此外，MSCs 還具有分泌能力強、分泌量多的特點，這使得MSC-EVs 的分析鑒定具有其他EVs 無可比擬的優勢。

4 MSC-EVs生物學功能

雖然因來源及所處的微環境不同，MSC-EVs內含物的種類和數量有所差異，但其作用于靶細胞的方式基本相同，主要包括3 大類[15-16]：①識別靶細胞表面的特異性受體，通過受體-配體相互作用激活或者抑制靶細胞內的轉導通路；②直接與受體細胞的質膜相互融合，將細胞膜表面受體分子和脂質體傳遞給受體細胞；③通過內吞或靶向傳遞其內含的生物活性物質。MSC-EVs 的主要生物學功能將在下文進行闡述。

4.1 組織損傷修復

早在2009年BRUNO 等[17]通過復制甘油誘導的小鼠急性腎衰竭模型證實了MSC-EVs 在急性腎損傷中的治療潛力。此后MSC-EVs 便被廣泛的應用于多種組織損傷動物模型中。在心肌梗死模型中，用轉染了GATA-4基因的MSC-Exos 對小鼠心肌內注射治療發現，MSC-Exos 能有限縮小梗死面積，增強心肌保護作用并促進其功能修復。進一步的實驗表明MSC-Exos 的修復功能主要與其攜帶的microRNAs 介導的抗凋亡作用相關[18]。LONATI 等[19]以大鼠模型來研究MSC-EVs 對肺損傷的修復作用，其首先復制了1 個180 min 的肺灌注大鼠模型，隨后采集灌注樣品進行氣體分析評估和肺活檢分析，發現MSC-EVs 可以有效緩解因肺缺血引起的ATP 降低，上調參與炎癥和氧化應激的相關基因，且生物學分布分析顯示，MSC-EVs 在肺組織內被保留并在肺細胞內被內化。該研究表明非細胞的EVs 治療可能是修復受損肺的一個有價值的策略。LEE 等[20]的在另一項肺缺氧損傷模型中得出了類似的結論，該研究發現MSC-Exos 可以通過抑制STAT3 信號通路的活化和miRNA-17 超家族簇的上調，增加miR-204 這一關鍵microRNA 在肺內的表達，從而修復缺氧組織，緩解缺氧引起的肺動脈高壓。

4.2 神經性保護和再生

SHEN 等[21]的一項腦內出血大鼠模型研究證實，miR-133b 修飾的MSC-Exos 能通過抑制腦出血后ras同源基因家族成員A 的表達及激活ERK1/ERK2/CREB 信號通路來抑制腦梗死后神經細胞的凋亡，促進神經細胞的自我修復。FAN 等[22]將20 周齡的糖尿病小鼠用作糖尿病周圍神經病變（DPN）模型，對其進行為期8 周的MSC-Exos 尾靜脈注射，結果顯示MSC-Exos 治療DPN 可以顯著降低糖尿病小鼠的熱刺激和機械刺激閾值，并提高神經傳導速度。進一步的microRNA（miRNA）芯片和生物信息學分析表明MSC-Exos 包含大量靶向Toll 樣受體TLR4/NF-κB 信號通路的miRNA，并通過抑制促炎基因來減輕DPN 小鼠的神經血管功能障礙，改善周圍神經病變。ZHANG 等[23]用MSC-Exos 對創傷性腦損傷進行治療后發現，大鼠腦病變邊緣區的新生上皮細胞及新生神經元細胞數量均有顯著增加，神經炎癥狀有明顯緩解。這一研究成功證實了通過促進內源性血管及神經生成，MSC-Exos 可有效促進腦功能恢復和神經血管重構。

4.3 免疫調節

MSC-EVs 可以發揮MSC 的多種免疫調節功能，其參與免疫調控作用的機制及在免疫相關疾病中的治療潛能引起了研究者的廣泛關注。LI 等[24]研究發現人臍帶MSC-Exos 通過其高表達的miR-181c 下調TLR4 通路，并降低血漿細胞因子TNF-α、IL-1β的含量，提高抑炎因子IL-10 水平，從而有效減輕免疫應答反應，發揮抗炎作用。ZHANG 等[25]的移植物抗宿主反應研究同樣證實MSC-EVs 的免疫活性，MSC-Exos 能夠通過激活單核細胞MyD88 依賴的信號通路誘導產生M2 表型的單核細胞，從而極化活化的CD4+T 細胞向Tregs 轉化，增加受體小鼠的Tregs，延遲同種異體皮膚移植排斥反應，提高移植的存活率。ZHAO 等[26]的最新研究發現脂肪MSC-Exos 可從脂肪間充質干細胞轉移至巨噬細胞，誘導M2 型巨噬細胞極化，緩解炎癥反應，這些發現有望為肥胖和糖尿病等疾病的治療提供潛在方案。此外，MSC-EVs 還表達程序性死亡配體1 和乳糖凝集素，兩者是CD4+CD25+T 細胞介導調控的關鍵效應分子，可以促進Treg 細胞增殖，同時MSCEVs 還參與誘導活化的細胞毒性T 細胞凋亡，并含有重要的負性免疫調控因子TGFβ1，可有效抑制自身免疫反應引起的組織損傷[27]。

4.4 自噬調節

MSC 來源的外泌體可通過mTOR 通路和p53-Bnip3 通路調控宿主細胞自噬，從而對疾病起到治療作用。XIAO 等[28]復制小鼠心肌梗死模型，并在心肌梗死后肌肉注射骨BMSCs，之后檢測發現BMSCs 的移植能有效減少心肌梗死后心肌細胞的凋亡，改善心臟功能。而進一步的研究證實是BMSCs分泌的BMSC-Exos 發揮了調控作用。BMSC-Exos 中的miR-125b 作用于心肌細胞，介導p53-Bnip3 信號通路下調心肌細胞的自噬水平，減少心肌細胞自噬性死亡。LO 等[29]將大鼠腎上皮細胞（NRK-52E）與人臍帶來源間充質干細胞來源的外泌體（hucMSC-Exos）共培養時發現hucMSC-Exos 可增加NRK-52E 中自噬標志性蛋白LC3B 的表達，并上調自噬相關基因atg5、atg7。進一步腎毒性大鼠模型研究結果顯示，hucMSC-Exos 移植對腎損傷有治療作用，由此可以推測hucMSC-Exos 可通過mTORC1通路介導的自噬來緩解大鼠腎臟損[29]。EBRAHIM等[30]在糖尿病腎病大鼠模型研究中也得出了一致的結論。

MSC-EVs 攜帶大量miRNA、mRNA 及各類因子，在組織損傷修復及疾病診療領域發揮重要作用，總結其作用機制主要有抗炎、抗凋亡、抗纖維化、免疫調節、自噬調節及促血管生成等方面。見表1。

表1 MSC-EVs的應用領域及作用機制

5 MSC-EVs的應用前景

近年來EVs 特別是Exos 受到了廣泛的關注，已成為精準醫療時代的一個臨床熱點領域。MSC 作為一種EVs 分泌能力最強的細胞類型，更是贏得了科研工作者的青睞。有研究發現MSC-EVs 在輻射損傷救治領域具有其獨特的優勢，MSC-EVs 除具備MSC 相當的促造血系統重建及組織修復功能外，還避免了治療過程中異常分化，增殖、阻塞血管等MSC 內在的缺陷[31]。MSC-EVs 有較母體小的多的體積、更易透過血腦等生物屏障、性質穩定、可進行大規模制備等特性，這些優勢使MSC-EVs 有望取代MSCs，在組織修復再生及免疫調節領域發揮重要作。

MSC-EVs 除本身可以用于疾病治療外，還可作為天然的基因和藥物載體。EVs 的脂質雙分子層結構在靶向運輸的過程中可有效保護其搭載的藥物及內容物，防止被稀釋或酶類降解。EVs 的類似于細胞膜的組成和結構使其可以有效降低自身免疫反應，具有較好的生物相容性，使得搭載的藥物能與靶細胞進行高效結合并發揮效應。已有一些相關研究證實了外泌體載藥的可行性及高效性。如已有研究報道利用電穿孔方法將藥物轉入MSCExos，實現MSC-Exos 對藥物的運載[32]。PASCUCCI等[33]首次證實了干細胞來源的微泡具有搭載并運輸藥物至靶細胞的能力。將包含有紫杉醇的MSCMVs 與胰腺癌細胞共培養后發現MSC-MVs 的抗腫瘤增殖效果顯著增強，這說明MSC-MVs 靶向運輸紫杉醇至胰腺癌細胞發揮了抗腫癌效應。此外，還可將感興趣的基因或RNA 整合至EVs，然后以膜融合方式將其釋放至靶細胞發揮生物學效應。LOU等[34]的研究就為這一潛在應用提供有力的證據，將miR-122 包裹入脂肪來源的MSC-Exos 中，miR-122修飾的MSC-Exos 可以介導miR-122 在脂肪MSC 與肝癌細胞之間的通訊，改變miR-122靶基因在肝癌細胞中的表達，使癌細胞對化療藥物敏感。

MSC-EVs 的應用前景毋庸置疑，但是就目前的水平而言，MSC-EVs 的深入研究及臨床轉化仍存在很多限制：①MSC-EVs 的獲取方法是第一大瓶頸，至今尚無一種能集經濟實惠、簡單高效、高純無損于一體的EVs 提取方法，EVs 的產量和純度均無法保證；②MSC-EVs 的分析鑒定尚無標準化流程，不同來源的EVs 的標志物并不十分明確，EVs 的數量無法標準量化給臨床研究帶來更大的挑戰；③MSC-EVs 的組織修復，免疫調控等生物學功能的機制闡述尚不十分清楚，部分功能還存在爭議，故還需更多體內和體外實驗證實，尤其是臨床轉化的安全性需進一步評估。

綜上所述，隨著科學技術的不斷發展，MSCEVs 成分及功能的研究越發成熟，MSC-EVs 作為一種非細胞性治療方式，有著廣闊的應用前景。