無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)在診斷胎兒染色體非整倍體疾病中的應(yīng)用價(jià)值

覃顏

(珠海市斗門區(qū)婦幼保健院醫(yī)院，廣東 珠海 519125)

0 引言

染色體非整倍體異常屬于胎兒常見的一種染色體異常，每三百個(gè)胎兒中就有一個(gè)胎兒發(fā)病，主要包括13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征等[1]。其中21-三體綜合征也叫做唐氏綜合征，患兒表現(xiàn)以先天智力低下、五官畸形、四肢畸形等癥狀為主[2]。因此產(chǎn)前檢查中準(zhǔn)確診斷胎兒染色體非整倍體疾病，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。上世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)在孕中期逐漸開展血清學(xué)篩查，隨著研究的深入，更多的無(wú)創(chuàng)性篩查指標(biāo)得到應(yīng)用[3]。無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)通過(guò)測(cè)量孕婦外周血，提取總游離DNA，然后使用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物學(xué)信息分析，獲得胎兒的游離DNA 片段，以此判斷胎兒的染色體異常情況[4]。無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)不對(duì)孕婦造成創(chuàng)傷，具有較高的敏感度和特異度，眾多研究證實(shí)該方法對(duì)21-三體綜合征的檢出率在99%左右[5]。為此，本文將對(duì)在胎兒染色體非整倍體疾病診斷中采用無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)的價(jià)值展開探討，詳細(xì)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本次研究共2685 例研究對(duì)象，均選自在我院進(jìn)行圍產(chǎn)期保健的單胎孕婦，選取時(shí)間范圍在2019 年01 月至2020 年06 月期間。其中219 例為唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)，431 例為臨界風(fēng)險(xiǎn)，2035例為沒有高危因素直接進(jìn)行早期唐篩和無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)。其中年齡最小19 歲，最大46 歲，平均年齡為(30.26±4.39)歲；孕周最小12 周，最大26 周，平均孕周(18.46±1.41)周。。全部孕婦及家屬了解研究?jī)?nèi)容，同意參與研究并簽字。

1.2 方法

標(biāo)本采集和處理：采集所有孕婦外周血7mL，放置于EDTA抗凝管中，8 個(gè)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行離心處理，離心環(huán)境4℃，離心速度3000r/min 和13000r/min 各進(jìn)行離心處理10 分鐘，做好血漿分離工作，分裝(每管650μL)放置于80℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。采取DNA 提取試劑盒(來(lái)源于德國(guó)，QIAGEN)應(yīng)用磁珠分離對(duì)樣品DNA 進(jìn)行抽提；應(yīng)用克列諾酶、T4 多聚核苷酸激酶和T4 DNA 聚合酶對(duì)所提取到的血漿DNA 末端進(jìn)行補(bǔ)平，在血漿DNA 的3"末端±基“A”，將特定接頭接在DNA 片段末端，應(yīng)用PCR 技術(shù)對(duì)含有接頭的兩端DNA 片段展開擴(kuò)增處理，獲取到與樣本相對(duì)應(yīng)的DNA 文庫(kù)，對(duì)所獲取到的DNA 文庫(kù)展開質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)符合要求展開上機(jī)測(cè)序。無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)：采取高通量基因測(cè)序展開產(chǎn)前篩查檢測(cè)，測(cè)序儀器選取為Illumina Nextseq500 二代測(cè)序儀，確保所獲得的有效reads 數(shù)大于等于400M，平均每個(gè)樣本reads 數(shù)大于等于4M。參考BWA map軟件將人類基因組參考序列圖譜和運(yùn)行序列展開對(duì)比。采取NIPT 分析系統(tǒng)(來(lái)源于廣州萬(wàn)德基因醫(yī)學(xué)科技有限公司)以分析結(jié)果為依據(jù)統(tǒng)計(jì)每一條染色體含有的序列個(gè)數(shù)。分析胎兒的患病風(fēng)險(xiǎn)以及染色體核型。

對(duì)于無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者，進(jìn)一步實(shí)施羊水穿刺或者胎兒染色體核型分析證實(shí)結(jié)果。在妊娠18 周至24 周期間通過(guò)超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取20mL 羊水，送至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，得到細(xì)胞，通過(guò)滴片處理后G 顯帶分析，每例觀察20 個(gè)分裂象。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 所有孕婦無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果情況

全部2685 例孕婦中，無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果顯示，74 例陽(yáng)性孕婦，陽(yáng)性檢出率2.76%，74 例陽(yáng)性孕婦中6 例為21-三體陽(yáng)性，2 例為18-三體陽(yáng)性，3 例為13-三體陽(yáng)性，63 例性染色體及其他染色體異常，詳情如表1 所示。

表1 無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果情況[n(%)]

2.2 無(wú)創(chuàng)DNA 和羊水染色體核型結(jié)果對(duì)比

對(duì)74 例陽(yáng)性孕婦進(jìn)一步行羊水穿刺檢查，結(jié)果9 例得到確診，6 例為21-三體陽(yáng)性，1 例為18-三體陽(yáng)性，0 例為13-三體陽(yáng)性，2 例性染色體及其他染色體異常；無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果和羊水染色體核型結(jié)果之間具有良好的一致性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳情如表2 所示。

表2 無(wú)創(chuàng)DNA 和羊水染色體核型結(jié)果對(duì)比[n(%)]

3 討論

胎兒染色體非整倍體疾病給患兒的家庭以及社會(huì)均帶來(lái)巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響到了我國(guó)新出生人口的素質(zhì)[6]。因此如何有效控制和減少出生缺陷，一直是臨床婦科重點(diǎn)關(guān)注的問題。目前臨床針對(duì)胎兒染色體非整倍體疾病診斷以血清學(xué)生化篩查為主，其中在孕中期進(jìn)行血清學(xué)三聯(lián)篩查法對(duì)該類型疾病的檢出率最高可達(dá)75%[7]。而酶聯(lián)免疫法作為主要的檢測(cè)方法應(yīng)用比較廣泛，但是該檢驗(yàn)方法容易受到多種因素的影響，造成各個(gè)單位診斷指標(biāo)有所區(qū)別，進(jìn)而造成診斷特異性和敏感性受到干擾，假陽(yáng)性率較高[8]。而羊膜腔穿刺、臍血穿刺雖然是目前胎兒染色體非整倍體疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法屬于侵入性操作，并且由于孕婦數(shù)量的不斷增多，現(xiàn)階段的衛(wèi)生資源無(wú)法滿足產(chǎn)前診斷需求[9]。

隨著臨床高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)逐漸應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病的診斷中。從本次研究結(jié)果看出，無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)共檢出74 例陽(yáng)性孕婦，而羊水穿刺檢查共證實(shí)9 例孕婦，可見無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果和羊水染色體核型結(jié)果之間具有良好的一致性(P＜0.05)。對(duì)于拒絕有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷或者存在侵入性產(chǎn)前診斷禁忌癥的孕婦，無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)具有快捷、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)，安全性較高，不會(huì)受到母體孕周或者生育年齡等因素的影響，避免了對(duì)孕婦和胎兒造成損傷[10]。無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)有效提高了產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，減少了傳統(tǒng)檢測(cè)方法給孕婦帶來(lái)的精神負(fù)擔(dān)，避免了羊水穿刺等侵入性操作造成的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，不會(huì)增加流產(chǎn)的發(fā)生幾率，為產(chǎn)前診斷提供了新方法，可作為傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)有效的輔助手段。本次研究中無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)存在一定假陽(yáng)性情況，可見無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)仍然一定的局限性。無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)只能對(duì)胎兒染色體拷貝數(shù)異常情況進(jìn)行檢出，而對(duì)于易位型、嵌合體、微缺失等結(jié)構(gòu)異常無(wú)法有效檢出，所以在產(chǎn)前診斷中可將無(wú)創(chuàng)DNA 檢測(cè)技術(shù)和其他產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合。

綜上所述，無(wú)創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測(cè)應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體疾病診斷中，具有較高的準(zhǔn)確率，同時(shí)操作便捷、安全性較好具有良好的臨床推廣意義。