響應面法優化菜籽粕的酶解條件

朱曉峰 張 楨 丁立人 杭蘇琴*

(1.南京農業大學動物科技學院，國家動物消化道國際聯合中心，南京210095；2.南京農業大學動物科技學院，動物科學類國家級試驗教學示范中心，南京210095)

菜籽粕(rapeseed meal，RSM)是油菜籽榨油之后的副產品，我國年產量高達926萬t，位居世界第一[1]。菜籽粕因其較高的粗蛋白質含量而具有替代動物飼糧中豆粕的潛力[2]。然而，菜籽粕中纖維含量(26.7%～28.3%)約為豆粕的3倍，其中不溶性纖維含量占總碳水化合物的45.22%，無法被畜禽充分消化吸收[3-4]。

據報道，纖維降解酶能有效地降低植物源飼料原料中的纖維含量，釋放小分子糖[5-6]。然而，目前關于菜籽粕纖維降解的研究較少。菜籽粕纖維以果膠(10.7%～14.5%)為主要成分，其次是纖維素(5.0%～7.0%)和少量的半纖維素[3,7]，它們共同構成復雜的細胞壁結構。雖然果膠是菜籽粕纖維的主要成分，但纖維素的存在阻礙了果膠酶與果膠活性位點的結合[8]。此外，細胞壁的降解不僅能釋放包裹在內的小分子蛋白質，還能產生可溶性糖[9]。酶解產生的可溶性糖經過微生物發酵可轉化為乳酸等發酵產物[10]。綜上可知，纖維素酶和果膠酶共同作用降解菜籽粕纖維，具有提高菜籽粕利用價值的潛力。

酶解條件如pH、溫度、酶解時間和底物濃度對酶解效率有顯著影響[9]。纖維素酶和果膠酶單獨酶解的最優酶解條件已被報道[11-12]，而有關2種酶復合后酶解菜籽粕條件的研究較少，因此優化復合纖維降解酶酶解菜籽粕的條件對酶解菜籽粕規模化生產的技術可行性具有重大意義。常規單因素試驗優化酶解條件不僅耗時，且需要大量的試驗，也沒有考慮變量之間的交互作用[13]。響應面法(response surface method)是一種用于多變量建模和優化的數學統計方法，能夠綜合評價一組變量與響應值(因變量)的關系，可用于優化酶解條件[14]。

本研究以還原糖轉化率為指標，利用響應面法優化復合纖維降解酶酶解菜籽粕的條件，以期提高菜籽粕的還原糖產量、降低其纖維含量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菜籽粕

本試驗所用菜籽粕(由甘藍型油菜籽制成)由江蘇某飼料有限公司提供，粉碎后過40目篩備用。

1.1.2 酶制劑

本試驗所用果膠酶、纖維素酶均由廣東某生物科技有限公司提供。試驗前，將酶粉用檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)溶解，8 000 r/min離心10 min后取上清，并檢測酶液活性。纖維素酶活性參照Ghose[15]的方法檢測，以濾紙酶活力單位(FPU)表示，果膠酶活性參考Li等[16]的方法進行檢測，以酶活力單位(U)表示。

1.2 試驗方法

1.2.1 復合纖維降解酶的確定

將5 g菜籽粕加入到125 mL發酵瓶中，加水47 mL混勻，使用1 mol/L HCl將pH調節至4.8，滅菌后備用；將過濾除菌(0.22 μm)酶液(3 mL)添加至發酵瓶中，菜籽粕濃度為100 g/L，試驗設3個組，每組設4個重復，各組發酵瓶中所加酶的具體情況如下：1)纖維素酶(10 FPU/g RSM)；2)果膠酶(10 U/g RSM)；3)纖維素酶(10 FPU/g RSM)+果膠酶(10 U/g RSM)。將發酵瓶置于50 ℃、150 r/min的恒溫搖床培養箱進行24 h的酶解，酶解結束后轉移至90 ℃恒溫水浴鍋中10 min終止反應；試驗結束后檢測菜籽粕的還原糖轉化率。

1.2.2 響應面試驗優化酶解菜籽粕條件

采用響應面試驗對復合纖維降解酶酶解菜籽粕的條件進行優化，以酶解菜籽粕中還原糖轉化率作為響應值，pH、溫度、酶解時間、底物濃度(即菜籽粕濃度)作為自變量，各因素設3個水平(表1)；根據Box-Behnken設計4因素3水平響應面試驗，共29個處理，其中5個處理為中心點重復試驗，每個處理設4個重復。以多元回歸方法將試驗數據擬合：

傾力打造了“習近平總書記治國理政重要思想”“黨建”“哈佛管理”“中歐在線MBA”“油氣技術”“直播大講堂”“國學精粹”“太極健身”等專題模塊課程，匯聚了國內外眾多知名專家教授。其中，“治國理政”和“黨建”課程269 門，“哈佛管理”課程230 門，“中歐在線MBA”課程88 門，“油氣技術”527 門，“國學與健身”等近100 門。

式中：Y為試驗響應值；βi、βii、βij分別為線性、二次和交互作用的系數；xi、xj,…,xk為獨立變量；K為變量數量；ε為隨機誤差。

利用失擬檢驗(lack-of-fit test)以檢驗所建立的模型是否足以描述所觀察到的數據；根據所建立的模型繪制響應曲面圖和響應的等高線圖，將響應與變量之間的關系可視化；統計軟件Design-Expert 9用于上述試驗數據的回歸分析以及圖的繪制。

表1 響應面試驗的因素和水平

1.2.3 最優酶解條件對菜籽粕纖維含量的影響

利用Design-Expert軟件對模型方程進行分析，得出復合纖維降解酶酶解菜籽粕的最優條件，探究此條件下菜籽粕的纖維含量。試驗共分為3組：1)優化組，按最優酶解條件進行；2)對照組，按優化前酶解條件(pH 4.8、溫度50 ℃、酶解時間24 h、底物濃度100 g/L)進行；3)空白組，按對照組酶解條件進行，以等量的無菌水替代酶液。酶解結束后于90 ℃恒溫水浴鍋中10 min以終止酶解反應。試驗結束后離心(8 000 r/min，10 min)取上清檢測還原糖轉化率；離心后剩余樣品置于65 ℃烘箱中24 h，烘干后采用濾袋法[17]檢測粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，采用凱氏定氮法[18]檢測粗蛋白質含量，采用氯化鈀法[19]測定硫代葡萄糖苷含量。

1.3 還原糖轉化率測定

使用二硝基水楊酸法[20]檢測上清中還原糖含量，參考Loman等[9]的方法計算還原糖轉化率，計算公式如下：

還原糖轉化率(%)=100×還原糖含量/菜籽粕濃度。

1.4 統計分析

數據以平均值±標準差(mean±SD)表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，通過SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Tukey’s法進行顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 復合纖維降解酶的確定

數據柱標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 響應面法優化酶解菜籽粕條件

2.2.1 模型建立及顯著性檢驗

使用復合纖維降解酶在不同酶解條件下對菜籽粕進行酶解，27個處理的試驗結果如表2所示。通過回歸分析獲得的模型如下：

Y=21.08-0.63A-0.71B+1.43C+0.12D+0.79AB-
0.11AC+0.06AD-0.81BC-0.41BD-0.65CD-
0.77A2-2.19B2-0.62C2-0.40D2。

式中：Y為復合纖維降解酶酶解菜籽粕中還原糖轉化率；A、B、C、D分別為pH、溫度、酶解時間、底物濃度。

方差分析結果如表3所示。該模型R2=0.916>0.80，意味著該模型可以解釋約91.6%的反應可變性；模型失擬項(lack of fit)P=0.092>0.05，說明該模型擬合度高。基于方差分析結果，線性系數中的pH(A)、溫度(B)和酶解時間(C)對響應值的影響為極顯著(P<0.01)；交互作用中pH與溫度(AB)、溫度與時間(BC)對響應值的影響為顯著(P<0.05)。上述結果說明pH、溫度和酶解時間是影響酶解菜籽粕中還原糖轉化率的主要因素。

2.2.2 因素之間交互作用分析

如圖2-A所示，當pH為3.2～4.0、溫度為45～49 ℃時還原糖轉化率最高，pH和溫度的升高均會使還原糖轉化率降低，三維響應面圖較陡峭，說明pH和溫度這2個因素間存在正向交互作用；如圖2-B所示，溫度和酶解時間的響應面呈馬鞍狀，溫度在47～51 ℃時，還原糖轉化率達到峰值所需要的時間較短(24 h)，當溫度超過此范圍時，還原糖轉化率達到峰值所需的時間增加(30 h)，說明溫度和酶解時間之間存在正向交互作用。

2.3 最優條件下酶解對菜籽粕還原糖轉化率和纖維含量的影響

利用Design Expert軟件進行分析，得到各因素的最優值為：pH 3.98、溫度49.62 ℃、酶解時間28.16 h、底物濃度200 g/L。在此條件下，還原糖轉化率的預測值為21.11%，為便于操作，將最優條件設置為：pH 4.0、溫度50 ℃、酶解時間28 h、底物濃度200 g/L。如表4所示，優化組還原糖轉化率達23.13%，與預測值接近，且顯著高于對照組的19.80%(P<0.05)；與對照組相比，優化組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著降低(P<0.05)；酶解對菜籽粕中粗蛋白質和抗營養因子硫代葡萄糖苷含量無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 復合纖維降解酶的確定

纖維素酶主要包含內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-糖苷酶活性，它們的共同作用是能夠通過打破纖維素中的1,4-β-糖苷鍵將纖維素降解為葡萄糖[21]；而果膠酶主要由同質半乳糖降解酶和鼠李半乳糖降解酶組成，能夠分解果膠多糖產生以半乳糖為主的降解產物[22]。葡萄糖和半乳糖均屬于還原糖，以還原糖轉化率為指標能夠有效的描述這2種酶的酶解效率。本試驗結果表明，纖維素酶和果膠酶同時添加時的還原糖轉化率(19.71%)優于兩者單獨添加時(纖維素酶：8.19%；果膠酶：16.45%)。這與前人研究結果一致，Matsuo[23]指出，纖維素酶和果膠酶同時酶解豆渣纖維釋放可溶性糖的含量高于各酶單獨添加；Spagnuolo等[24]也發現纖維素酶替代部分果膠酶能夠顯著提高酶解甜菜渣纖維釋放單糖的效率，說明這2種酶共同使用能夠使酶解效率最大化。

表2 4個獨立變量的響應面試驗設計及還原糖轉化率結果

表3 變量之間關于還原糖轉化率響應的方差分析

圖2 pH與溫度(A)、溫度與酶解時間(B)對酶解菜籽粕還原糖轉化率的響應面

3.2 響應面法優化酶解菜籽粕的條件

pH可影響酶的空間結構，從而改變酶的構象及活性，本研究中pH約為4.0時還原糖轉化率最高。有研究報道，升高酶解反應的溫度可促進纖維溶解，從而提高還原糖轉化率，溫度過低則會抑制酶的活性，降低酶解效率[25]。本研究結果表明，復合纖維降解酶的最適溫度為50 ℃，過高或過低均會降低酶解效率。Loman等[9]利用復合纖維降解酶酶解豆粕，溫度在48～51 ℃時總可溶性糖和還原糖的轉化率最高。

增加底物濃度可提高酶解過程中還原糖的含量。本研究中，在所試范圍內(100～200 g/L)，底物濃度對還原糖轉化率無顯著影響，表明在此范圍內更高的底物濃度能夠在不影響酶解效率的情況下獲得更多的還原糖。優化后的酶解時間為28 h，類似的研究表明，利用復合纖維降解酶對豆粕進行酶解，將酶解時間由24 h延長至48 h對總可溶性糖和還原糖轉化率無促進作用[9]，說明選擇合適的酶解時間有利于生產成本的控制。

表4 最優條件下酶解對菜籽粕還原糖轉化率和化學成分含量的影響

本研究發現pH與溫度之間還存在正向交互作用。溫度越低，pH越低，酶解菜籽粕還原糖轉化率越高；酶解時間與溫度之間也存在正向交互作用，當酶解溫度在49 ℃、酶解時間為24 h時，還原糖轉化率達到最高，增加酶解時間會使還原糖轉化率降低，說明在優化酶解溫度的同時，時間成本也得到控制。類似的交互作用已被報道，Loman等[9]利用響應面法優化復合纖維降解酶酶解豆粕條件，發現pH和溫度對總可溶性糖和還原糖的轉化率具有正向交互作用；Mudgil等[26]利用響應面法優化纖維素酶酶解豆粕條件，發現酶解時間和溫度具有正向交互作用，說明在考察多個變量時，響應面法是優化酶解條件的有力工具。

3.3 最優條件下酶解對菜籽粕還原糖轉化率和纖維含量的影響

與優化前的酶解條件相比，酶解條件優化后還原糖轉化率顯著提高(19.80% vs. 23.13%)，說明酶解條件優化是一種可行的提高菜籽粕纖維酶解效率的策略。Chen等[11]優化了纖維素酶酶解玉米芯多糖的酶解時間和底物濃度，使還原糖轉化率提高了7.5%。Gao等[27]研究顯示，由于優化后的酶解條件中底物濃度提高了2倍(200 g/L vs. 100 g/L)，酶解產物中還原糖含量是優化前的2.34倍(19.80 g/L vs. 46.27 g/L)；而高濃度的可發酵糖有利于酶解產物進一步發酵轉化為其他高價值化學品。酶解降低了菜籽粕中粗纖維、酸性洗滌纖維(包括纖維素和木質素)和中性洗滌纖維(包括纖維素、半纖維素和木質素)的含量，說明纖維的降解是還原糖產生的主要原因。此外，與對照組相比，在最優條件下酶解提高了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的降解程度，這也進一步證實了酶解條件優化的有效性。酶解對菜籽粕中粗蛋白質和硫代葡萄糖苷含量無顯著影響。有研究發現，乳酸桿菌等復合菌發酵菜籽粕能夠使菜籽粕的粗蛋白質含量提高12.08%，硫代葡萄糖苷含量降低85.05%[28]。本研究使用的復合纖維降解酶能夠降解纖維，而乳酸桿菌發酵則利用底物進行生長并產生代謝產物，兩者對菜籽粕的營養價值均有改善作用，而酶解與發酵結合是否能夠進一步改善菜籽粕營養價值，還需進一步研究。

4 結 論

利用響應面法優化復合纖維降解酶(纖維素酶+果膠酶)酶解菜籽粕的條件后可有效提高菜籽粕的還原糖產量，降低其纖維含量。優化后的酶解條件為pH 4.0、溫度50 ℃、酶解時間28 h、底物濃度200 g/L。