紅鰭東方鲀幼魚適宜投喂頻率和投喂水平的研究

衛育良 王建學 徐后國 梁萌青*

(1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗，青島266237)

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)是主要的河鲀養殖品種之一，也是農業農村部和國家食藥總局聯合簽發的2種有條件開放養殖的河鲀魚之一[10]。由于受到自1990年起河鲀“禁食令”的影響，紅鰭東方鲀相關營養學研究錯過水產動物營養與飼料研究的快速發展階段，研究基礎非常薄弱，直接導致現階段的養殖過度依賴鮮雜魚而缺乏專用配合飼料[11]。針對這一現狀，本團隊從2017年至今圍繞紅鰭東方鲀營養生理與飼料研發開展了大量的研究工作[11-19]，以期能填補紅鰭東方鲀營養需求參數的空白。基于這一目的，本試驗開展了紅鰭東方鲀適宜投喂頻率和投喂水平的研究。同時，考慮到紅鰭東方鲀在養殖過程中存在嚴重的相互殘食現象，而投喂頻率和投喂水平對緩減魚類養殖過程中的相互殘食現象具有重要的作用[20]，這進一步表明在紅鰭東方鲀上開展適宜投飼頻率和投喂水平研究的必要性。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

在本試驗中，紅鰭東方鲀投喂頻率和投喂水平試驗同時進行，其中投喂頻率試驗結合實際生產過程，設2(07:00、17:00)、3(07:00、12:00和17:00)和4次/d(07:00、12:00、17:00和21:00)共3個投喂頻率，分別記為F2、F3和F4組。試驗飼料選用商品料，購自青島賽格林生物科技有限公司，其粗蛋白質含量為47.74%，粗脂肪含量為10.01%。投喂過程采用自由采食，表觀飽食投喂(觀察魚的攝食情況，當超過80%的魚沒有攝食行為時，判定為達到表觀飽食水平[12])。投喂水平試驗也選用相同的商品飼料，投喂水平設為魚體體重的2%、4%、6%、8%和10%共5個投喂水平，分別記為R2、R4、R6、R8和R10組，所有投喂水平均采用3次/d(07:00、12:00、17:00)的投喂頻率。

1.2 試驗魚及養殖管理

養殖試驗所用紅鰭東方鲀幼魚購自河北唐山海都水產食品有限公司，養殖試驗在海陽市黃海水產有限公司進行，試驗開始前，先進行28 d的轉餌馴化，使紅鰭東方鲀幼魚從攝食鮮雜魚轉為配合飼料，然后進行剪牙處理，以減輕養殖試驗過程中紅鰭東方鲀之間可能的相互殘食。轉餌及剪牙結束后，繼續暫養14 d，然后饑餓24 h，開始正式養殖試驗。在投喂頻率試驗中，將270尾初始體重15 g左右的大小均勻、體格健壯且體表無明顯傷痕的紅鰭東方鲀隨機放入9個養殖桶(0.7 m×0.7 m×0.4 m)，每桶放30尾，每組3個重復，每個重復30尾魚。在投喂水平試驗中，將450尾初始體重15 g左右的大小均勻、體格健壯且體表無明顯傷痕的紅鰭東方鲀放入相同的15個養殖桶內，每桶放30尾，每組3個重復，每個重復30尾魚。對試驗中未攝食的飼料用虹吸法收集，烘干并稱重，記錄殘餌重量。養殖試驗周期為28 d，養殖期間采用自然光照，流水養殖，水溫為18～22 ℃，鹽度為30～31，pH為7.4～8.2，溶解氧含量為5～7 mg/L。

1.3 樣品采集

試驗結束前，按照正常投喂過程進行最后1次投喂，攝食結束后2 h，在流水狀態下，從養殖桶進水口取水樣，作為空白對照；從養殖桶出水口取水樣，用于養殖水體的水質分析。同時，對所有紅鰭東方鲀幼魚進行24 h饑餓處理，然后對每桶魚進行計數、稱重，用于測定和計算魚的相關生長指標。然后，每桶隨機取2尾魚，用肝素鈉處理過的1 mL注射器于魚的尾靜脈處抽血，抽血后解剖后取肝臟，液氮速凍后，保存到-80 ℃冰箱中，用于相關酶活性分析。最后，每桶再隨機取4尾未抽血的魚，-20 ℃保存，用于魚體成分分析。

1.4 指標測定

1.4.1 飼料及魚體成分分析

飼料和魚體的粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分和水分含量采用AOAC[21]標準方法測定。取樣后，飼料和全魚樣品放入105 ℃烘干至恒重，采用濕重法計算得到水分含量。粗蛋白質含量采用凱氏定氮儀測定(UDK142 automatic distillation unit，VELP，意大利)總氮含量，再乘以6.25計算得到粗蛋白質含量。粗脂肪含量采用索氏抽提法(Foss Tecator，Hoganas公司，瑞典)測定，抽提液為沸點30～60 ℃的石油醚。粗灰分含量采用先炭化后灰化的方法，灰化是在馬弗爐中灼燒至恒重。

1.4.2 肝臟酶活性分析

準確稱取肝臟組織樣品，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例稀釋，在冰浴條件下勻漿，制成10%的組織勻漿液，然后離心，取上清液備測。測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，按照說明書上的步驟用分光光度計(UV-5200型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司)或酶標儀(Infinite M200 luminometer，Tecan公司，瑞士)進行酶活性測定。胰蛋白酶活性檢測采用胰蛋白酶測定試劑盒(紫外比色法，A080-2-2)，用分光光度計在波長253 nm下測定吸光度值。糜蛋白酶活性檢測采用糜蛋白酶測定試劑盒(A080-3-1)，脂肪酶活性檢測采用脂肪酶測定試劑盒(比色法，A054-1-1)，肝臟淀粉酶活性檢測采用α-淀粉酶測試盒(淀粉-碘比色法，C016-1-1)，谷草轉氨酶(AST)活性檢測采用谷草轉氨酶測試盒(C010-2-1)，谷丙轉氨酶(ALT)活性檢測采用谷丙轉氨酶測試盒(賴氏法，C009-2-1)，均用酶標儀在相關酶對應波長下檢測。

1.4.3 養殖水體中氨態氮和磷酸鹽含量分析

養殖水體中氨態氮含量測定根據在弱堿性環境下，氨與苯酚和次氯酸鹽反應生成靛酚藍的原理，采用靛酚藍分光光度法在640 nm波長處測定吸光度值；亞硝態氮含量測定根據酸性環境下，亞硝酸鹽和磺胺會發生重氮化反應后，其產物與鹽酸萘乙二胺耦合生成紅色偶氮染料的原理，采用鹽酸萘乙二胺分光光度法在543 nm波長處測定吸光度值；磷酸鹽含量測定根據酸性環境下，磷酸鹽與鉬酸銨反應生成磷鉬黃，再用抗壞血酸還原生成磷鉬藍的原理，采用磷鉬藍分光光度法在882 nm波長處測定吸光度值。

1.5 計算方法及統計分析

成活率(SR)、攝食率(FI)、特定生長率(SGR)、FER、肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和肥滿度(CF)的計算參考以下公式：

SR(%)=100×試驗結束時每桶魚數量/
試驗開始時每桶魚數量；
FI(%/d)=100×總干物質攝食量/[試驗天數×

(初始體重+終末體重)/2]；
SGR(%/d)=100×(ln終末體重-
ln初始體重)/試驗天數；
FER=(終末體重-初始體重)/
攝入飼料干物質重；
HSI(%)=100×肝臟重/體重；
VSI(%)=100×內臟重/體重；
CF(g/cm3)=100×體重/體長3。

試驗結果以平均值±標準誤(mean±SE)表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。統計分析前，先分別用SPSS 20.0上的Shapiro-Wilk和Levene’s檢驗進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗，然后進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當差異顯著時，進行Tukey多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚生長和飼料利用的影響

由表1可知，在投喂頻率試驗中，不同投喂頻率對紅鰭東方鲀幼魚終末體重、SR、FI、SGR和FER均無顯著影響(P>0.05)。

在投喂水平試驗中，不同投喂水平顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的終末體重、FI、SGR和FER(P<0.05)。R2組終末體重顯著低于R4、R8、R10組(P<0.05)；R2組FI、SGR和FER顯著低于其他各組(P<0.05)，但其他各組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚形體指標的影響

由表2可知，在投喂頻率試驗中，不同投喂頻率顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的HSI和VSI(P<0.05)，對CF無顯著影響(P>0.05)。F3組HSI和VSI顯著高于F2組(P<0.05)。

在投喂水平試驗中，不同投喂水平顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的HSI和VSI(P<0.05)，對CF無顯著影響(P>0.05)。R2組HSI顯著低于其他各組(P<0.05)。R2組VSI最低，顯著低于R8和R10組(P<0.05)，但與R4和R6組無顯著差異(P>0.05)。

2.3 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚體成分的影響

由表3可知，在投喂頻率試驗中，不同投喂頻率對紅鰭東方鲀幼魚的粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分和水分含量均無顯著影響(P>0.05)。

在投喂水平試驗中，不同投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚的粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分和水分含量均無顯著影響(P>0.05)。

表1 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚生長和飼料利用的影響

表2 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚形體指標的影響

2.4 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚肝臟消化酶活性的影響

由表4可知，在投喂頻率試驗中，不同投喂頻率顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的肝臟胰蛋白酶和脂肪酶活性(P<0.05)，對肝臟糜蛋白酶和淀粉酶活性無顯著影響(P>0.05)。F3組肝臟胰蛋白酶和脂肪酶活性顯著高于F2和F4組(P<0.05)。

在投喂水平試驗中，不同投喂水平顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的肝臟胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性(P<0.05)，對肝臟淀粉酶活性無顯著影響(P>0.05)。R2組肝臟胰蛋白酶活性最低，顯著低于R4、R8和R10組(P<0.05)；R2組肝臟糜蛋白酶活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)；R2組肝臟脂肪酶活性最低，顯著低于R4組(P<0.05)，但與R6、R8和R10組無顯著差異(P>0.05)。

2.5 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚肝臟蛋白質代謝相關酶活性的影響

由表5可知，在投喂頻率試驗中，不同投喂頻率顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的肝臟ALT活性(P<0.05)，對肝臟AST活性無顯著影響(P>0.05)。F3組肝臟ALT活性顯著低于F2組(P<0.05)。

在投喂水平試驗中，不同投喂水平顯著影響紅鰭東方鲀幼魚的肝臟ALT活性(P<0.05)，對肝臟AST活性無顯著影響(P>0.05)。R2組肝臟ALT活性最低，顯著低于R4和R10組(P<0.05)，但與R6和R8組無顯著差異(P>0.05)。

表3 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚體成分的影響(濕重基礎)

表4 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚肝臟消化酶活性的影響

2.6 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚養殖水質指標的影響

由表6可知，在投喂頻率試驗中，盡管各試驗組養殖水桶出水口的氨態氮、亞硝態氮和磷酸鹽含量相比進水口空白對照組均有所升高，但不同投喂頻率對紅鰭東方鲀幼魚的養殖水質指標均無顯著影響(P>0.05)。

在投喂水平試驗中，與投喂頻率試驗的結果類似，盡管各試驗組養殖水桶出水口的氨態氮、亞硝態氮和磷酸鹽含量相比進水口空白對照組大部分有所升高，但不同投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚的養殖水質指標均無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚生長和飼料利用的影響

自由采食和白天投喂是水產養殖實際生產中主要投喂策略，本研究結合實際養殖過程設3個投喂頻率，結果發現終末體重、SR、SGR、FI和FER在不同投喂頻率組之間均無顯著差異，其原因可能主要有2個方面：第一，2次/d的投喂頻率已滿足紅鰭東方鲀幼魚生長的需要，因此，繼續提高投喂頻率，對生長無顯著促進。類似的結果在多種魚類上發現，如在大菱鲆上，Zheng等[1]報道，1次/d的投喂頻率可滿足大菱鲆的生長，繼續提高至2和3次/d，均沒有進一步提高大菱鲆的生長；在施氏厚唇麗魚(Iodotropheussprengerae)上，Karadal等[2]從每2天1次到每天4次的投喂頻率研究發現，施氏厚唇麗魚在每天2次投喂即達到最適投喂頻率。第二，可能受當時養殖場地及試驗條件限制選擇28 d較短的養殖周期有關。在之前一些投喂頻率研究中，養殖周期會選擇8周或者更長的時間[2-3,22-24]，但養殖周期長短主要由魚的生長速度決定，而紅鰭東方鲀是生長速度較快的魚類，在本試驗中盡管只有28 d的養殖周期，但紅鰭東方鲀的終末體重相比初始體重增加了131%～146%，且在同時進行的相同養殖周期投喂水平試驗中，不同投喂水平顯著影響了紅鰭東方鲀幼魚的終末體重、FI、SGR和FER，這表明盡管可能存在養殖周期較短影響投喂頻率試驗中生長結果在不同投喂頻率下無顯著差異，但這種影響因素可能不是主要的。類似研究在大菱鲆上也有發現，生長結果受投喂頻率變化的影響不顯著而受投喂水平變化的影響顯著[1]。此外，在投喂水平試驗中，發現所有SGR、FER等主要反映生長性能的指標均在投喂水平為體重的4%的情況下出現拐點，且投喂水平為體重的4%～10%時，FI均在約3.2%，表明這一投喂水平已經能夠滿足紅鰭東方鲀幼魚生長需要，過高投喂水平會造成飼料浪費。同時，本研究的結果也暗示在紅鰭東方鲀的養殖投喂策略中，投喂水平對生長的影響大于投喂頻率，因此，在養殖過程中，應該更加關注投喂水平，保證每次投喂能夠達到飽食狀態。此外，紅鰭東方鲀在養殖過程中，存在嚴重的相互殘食現象，從而導致較高的死亡率[12]。一些研究發現，適宜的投喂頻率和投喂水平均能有效緩減魚類養殖過程中的相互殘食[20]。而在本研究中，無論是在投喂頻率還是投喂水平試驗中，紅鰭東方鲀的SR均高達96.67%～100%，且各組之間無顯著差異，這一結果高于之前本團隊關于紅鰭東方鲀營養學研究中所有養殖試驗的SR[12-16,18-19]。其原因可能是，在本試驗的養殖過程中，通過添加深井海水，養殖水體的水溫維持在18～22 ℃，從而導致盡管紅鰭東方鲀養殖中存在相互殘食的現象，但由于水溫合適，殘食引起的死亡率并沒有隨之升高。因此，在本試驗條件下，無法通過死亡率對投喂頻率和投喂水平影響紅鰭東方鲀相互殘食效果作出評價。

表5 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀肝臟蛋白質代謝相關酶活性的影響

3.2 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚體成分和形體指標的影響

表6 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚養殖水質指標的影響

3.3 投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚消化酶和蛋白質代謝相關酶活性的影響

投喂頻率和投喂水平不僅會影響魚類等水生動物的生長，而且會影響內源性消化酶的活性[6,31-32]。因此，本研究分析了投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀肝臟消化酶活性的影響。結果發現，在投喂頻率試驗中，3次/d的投喂頻率顯著提高肝臟胰蛋白酶和脂肪酶活性，表明適宜的投喂頻率能提高消化酶的活性[31-32]，但本試驗消化酶活性變化的拐點與生長結果所反映的適宜投喂頻率并不一致，在生長結果中，2次/d的投喂頻率即可滿足生長，這種現象也在俄羅斯鱘魚(Acipensergueldenstaedtii)的研究中發現，以生長結果為評價指標得到的適宜投喂頻率為3次/d，但消化酶活性變化的拐點卻出現在4次/d的投喂頻率組[33]，產生這種不一致的原因可能是生長是魚類對投喂頻率變化的整體響應，它不僅反映消化能力，而且反映魚類的攝食、吸收、代謝等綜合情況，而消化酶活性僅從消化層面反映魚類對投喂頻率的響應。在投喂水平試驗中，消化酶活性變化與生長結果一致，均是每天投喂體重的4%出現統計學上的最大值。同時，與投喂頻率試驗相似，投喂水平試驗中消化酶活性產生差異的也為蛋白酶和脂肪酶，這表明投喂策略的改變主要影響紅鰭東方鲀蛋白質和脂肪的消化，而對淀粉等糖類的消化影響不明顯，類似的結果在大黃魚的研究中也發現投喂頻率對淀粉酶活性影響不明顯[32]，分析原因可能與魚類先天對糖的利用率低有關[34]。

既然投喂頻率和投喂水平均會影響紅鰭東方鲀肝臟蛋白酶活性，因此，本研究進一步分析其對肝臟蛋白質代謝相關酶活性的影響。魚類蛋白質代謝中，有2個重要的氨基酸分解酶，分別為AST和ALT，其中AST的主要作用為將天冬氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和草酰乙酸，ALT的主要作用為將丙氨酸和α-酮戊二酸催化生成谷氨酸和丙酮酸，而草酰乙酸和丙酮酸可以進入三羧酸循環參與能量代謝，因此，AST和ALT活性變化，除了表明會影響肝臟中能量代謝的活性，還表明會影響肝臟中轉氨基的活性[35-37]。本試驗中，雖然不同投喂頻率和投喂水平對肝臟AST活性無顯著影響，但顯著影響肝臟ALT活性，在投喂頻率試驗中，表現為3次/d的投喂頻率組肝臟ALT活性最高，類似的結果也出現在巨滑舌魚(Arapaimagigas)上[38]；在投喂水平試驗中，同樣也發現肝臟ALT活性在每天投喂體重的4%的投喂水平組顯著升高，并且肝臟ALT活性隨飼料投喂頻率和投喂水平的變化與蛋白質和脂肪消化酶活性的變化趨勢一致，這從另一個方面證明投喂頻率和投喂水平變化不僅影響蛋白質消化，而且影響氨基酸的分解代謝。

3.4 飼料投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀幼魚養殖水體中氨態氮、亞硝態氮和磷酸鹽含量的影響

之前的研究證明，投喂頻率和投喂水平會對水產動物養殖水體的水質產生重要影響，特別是池塘養殖、循環水養殖等處于靜水狀態下的養殖，氨態氮、亞硝態氮、磷酸鹽等在水體中的含量會隨著投喂水平或投喂頻率(飽食投喂下)增加而顯著升高[1,5-6,39-40]。而我國沿海的工廠化養殖中采用的養殖模式主要為流水養殖模式，這種養殖模式下的投飼頻率和投喂水平對養殖水體氨態氮含量等重要水質指標的影響卻缺乏研究。基于此，本試驗模擬現階段工廠化養殖最常用的流水養殖，研究投喂頻率和投喂水平對紅鰭東方鲀養殖水體水質的影響，結果發現，氨態氮、亞硝態氮和磷酸鹽含量這3個重要水質指標雖然在投喂結束后2 h在養殖水桶的出水口相比進水口數值上有所升高，但不同投喂頻率和投喂水平均對這3個指標均無顯著影響，表明在流水養殖情況下，由于飼料及魚體排泄產生的氨態氮等會隨著水流排出養殖水體，因此，投喂策略對養殖水體水質變化的影響極小。

4 結 論

根據生長及消化酶活性結果，在本試驗條件下，初始體重為15 g左右的紅鰭東方鲀幼魚適宜的投喂頻率為2～3次/d，投喂水平為體重的4%。此外，在流水養殖模式下，不同投喂頻率和投喂水平對養殖水體氨態氮、亞硝態氮和磷酸鹽含量的影響極小。