基于胰島素樣生長因子-Ⅰ信號通路體外研究丁酸鈉促進羔羊瘤胃上皮細胞增殖的機理

張雅麗 劉理想 孫大明 劉軍花

(國家動物消化道營養國際聯合研究中心，江蘇省消化道營養與動物健康重點實驗室，南京農業大學動物科技學院消化道微生物研究室，南京210095)

瘤胃作為反芻動物特有的消化吸收器官，其發育狀態直接影響反芻動物生產性能和健康。而新生反芻動物瘤胃功能發育尚不完善，不能夠充分地消化和吸收固體飼料[1]，所以在生產中通過營養手段促進幼齡反芻動物瘤胃的發育和成熟對提高動物生產性能和維持動物健康具有重要意義。瘤胃的發育成熟包括瘤胃微生物區系的建立健全及瘤胃上皮形態和功能的完善；瘤胃微生物區系的建立健全主要是保證高效消化植物性固體飼料產生揮發性脂肪酸(VFA)及菌體蛋白；瘤胃上皮功能的完善主要是保證高效吸收和代謝VFA，維持瘤胃穩態并為機體供能[2]。瘤胃上皮發育與細胞周期的變化密切相關。細胞周期包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1期、S期和G2期)和分裂期(M期)。其中，G1期調節細胞周期蛋白(Cyclin)DⅠ和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4的mRNA的大量表達，推動細胞周期快速進入S期[3-4]，在S期急速合成與DNA復制相關的酶類[5-6]。

近期研究表明，口腔灌服0.36 g/kg BW的丁酸鈉可促進哺乳期羔羊瘤胃乳頭的生長，并且該過程與瘤胃上皮細胞增殖的加速和細胞凋亡的抑制相關[7-8]，表明灌服適宜劑量丁酸鈉對瘤胃上皮的發育有促進作用[9]，但是灌服不同劑量丁酸鈉對瘤胃上皮細胞的促進作用及機制需進一步探明。研究證實，瘤胃發酵產物丁酸在體內條件下能夠促進瘤胃上皮發育，但單獨在體外試驗中卻沒有發揮作用[8]，上述研究提示，丁酸促進瘤胃上皮發育并非直接作用，可能與某些激素調節作用密切相關[9]。同時，相關研究發現，在培養基中添加適量的胎牛血清有利于細胞的生長，這可能是胎牛血清中的胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)誘導細胞周期停滯的成纖維細胞CyclinDⅠ表達和Cyclin-CDK4復合物合成，進而加快細胞增殖，于是采用無血清的培養基培養細胞，單獨添加適量的IGF-Ⅰ后，2 d內細胞增殖明顯加快，合成的DNA量也明顯增多[10]。

在單胃哺乳動物中，IGF-Ⅰ可以通過自分泌或旁分泌方式調節多種組織的細胞增殖和凋亡，IGF-Ⅰ和胰島素樣生長因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)結合后可以激活下游多條信號轉導通路，將相關細胞信號從細胞外轉導至細胞內，激活轉錄因子，發揮其促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的生物學效應[11-13]。而在新生反芻動物上尚未有相關報道?，F有研究表明，灌服丁酸鈉促進反芻動物瘤胃上皮細胞增殖與IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和瘤胃上皮增殖因子密切相關[14-17]。因此，本文通過體外細胞試驗，研究不同濃度丁酸鈉對瘤胃上皮細胞周期進程和細胞凋亡的影響，再進一步探究丁酸鈉通過IGF-Ⅰ信號通路調控瘤胃上皮細胞增殖的作用機制，為生產中通過營養手段促進幼齡反芻動物瘤胃的發育和成熟、提高動物生產性能和維持動物健康提供依據。

1 材料與方法

1.1 瘤胃上皮細胞的分離與培養

試驗選擇4只49日齡，性別一致，體重分別為11.3、12.9、11.2和11.0 kg的湖羊公羔羊用于細胞試驗。羔羊瘤胃上皮細胞的分離及培養參照Stumpff等[18]和盧勁曄[19]的方法進行了改進。具體操作步驟如下：

1)羔羊屠宰后立即分離瘤胃，用6倍的青鏈霉素的D-Hanks溶液多次沖洗，去除瘤胃內容物，然后再漂洗2～3次，能有效地去除殘留的細菌和真菌。

2)在D-Hanks溶液中小心地用分離工具如剪刀、鑷子、手術刀等鈍性分離黏附的漿膜和肌肉，收集瘤胃腹囊部上皮組織塊，然后再用D-Hanks溶液沖洗3次。

3)將瘤胃組織剪成小塊平鋪在錐形瓶底部，加入含0.25%的胰蛋白酶液(Gibco公司，美國)在37 ℃水浴中消化30 min，消化液沒過組織即可，每隔5 min輕輕搖晃，使其消化均勻。

4)重復上述胰蛋白酶消化步驟3次；若中途胰蛋白酶溶液出現渾濁，可進行更換；等到瘤胃上皮組織出現黏稠且乳頭發白，一般羊的瘤胃上皮組織的消化時間為2～3 h。

5)進入超凈臺操作，將上述處理后的上皮組織置于無菌燒杯中，用D-Hanks液清洗3次，更換燒杯再洗3次。

6)清洗后用含0.25%胰蛋白酶繼續消化，直到看到有細碎細胞脫落(大部分是橢圓形細胞時開始收集)，間隔5 min收集1次細胞消化液。

7)收集的細胞消化液用70 μm的濾膜進行過濾(事先在收集的離心管中加入2 mL的血清)后，在1 500 r/min下離心8 min收集細胞。

8)用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)將收集到的細胞沉淀清洗2次，用完全培養基重懸細胞后離心，然后調節細胞密度至1×106個/mL，接種到培養瓶中(除培養基外還要加入10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，置于5% CO2，37 ℃培養箱中培養。

9)培養1 h后，輕輕吸取上層懸液于另一培養瓶中繼續培養，換瓶培養重復2次可有效去除成纖維細胞；換瓶培養48 h后，更換新的完全培養液繼續培養(瓶底鋪滿明膠的培養瓶)，5 d后細胞大量貼壁，形態均一，呈鱗片狀，即綿羊羔羊瘤胃上皮細胞(圖1)。細胞貼壁后可進行試驗處理。

圖1 羔羊瘤胃上皮細胞消化分離后120 h生長情況

10)將細胞凍存，在鋪層至80%～90%時，PBS清洗2次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的質量分數為0.25%的胰蛋白酶消化4 min，終止消化后離心處理，重懸于凍存液[胎牛血清∶杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)=9∶1]，按照凍存步驟儲存于液氮中。

1.2 丁酸鈉和IGF-ⅠR抑制劑溶液配制

丁酸鈉溶液的配制：取1 g丁酸鈉(Sigma公司，美國)溶解于11.35 mL的DMEM中，配制成濃度為800 mmol/L的母液，試驗時再稀釋成所需要的濃度。

IGF-ⅠR抑制劑[鬼臼苦素(picropodophyllin，PPP)]溶液配制：將100 mg的IGF-ⅠR抑制劑(Merck Millipore公司，美國)溶解在100 μL的二甲基亞砜(Sigma公司，美國)中，然后加入9.5 mL的DMEM配制成濃度為2.5×10-4mol/L的母液。參照Duan等[20]研究，試驗時IGF-ⅠR抑制劑需要配制成濃度為2.5 μmol/L的溶液。

1.3 體外細胞試驗設計

待細胞貼壁大約80%后，更換培養基，將胎牛血清的濃度降至0.5%，饑餓12 h，使細胞同步化。然后將細胞分為4組，分別添加0、2、4、8 mmol/L丁酸鈉。為了進一步研究IGF-Ⅰ信號通路在添加丁酸鈉促進瘤胃上皮細胞增殖中的作用，將細胞分為3組，丁酸鈉組添加4 mmol/L丁酸鈉，抑制劑組添加4 mmol/L丁酸鈉+2.5 μmol/L IGF-ⅠR抑制劑(在添加丁酸鈉前1 h加入IGF-ⅠR抑制劑)，對照組加入相同體積的DMEM。所有細胞試驗重復4次。細胞處理24 h后收集細胞液用于測定IGF-Ⅰ濃度，收集細胞檢測細胞周期以及增殖和凋亡相關基因的表達。

1.4 細胞樣品采集

瘤胃上皮細胞培養24 h后，吸取1 mL的細胞培養液置于-80 ℃保存，用于IGF-Ⅰ濃度測定。剩余細胞培養液在1 500 r/min下離心10 min，獲得細胞沉淀，同時在細胞培養瓶中加入胰蛋白酶將貼壁細胞消化下來，2種細胞沉淀混合后，用PBS(pH 7.4)洗滌2次。一部分細胞用75%的乙醇固定，4 ℃避光過夜用于細胞周期的檢測；一部分細胞用TRIzol試劑重懸，置于-80 ℃保存用于RNA的提取。

1.5 細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度測定和細胞周期檢測

使用細胞培養液IGF-Ⅰ測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度。使用細胞周期檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)檢測細胞周期，采用FlowJo 7.6軟件進行分析處理。

1.6 總RNA提取和cDNA合成

使用RNAiso Plus(TaKaRa公司，日本)從勻漿的瘤胃上皮組織中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)測定提取的總RNA的濃度和純度。所有樣品的260/280 nm吸光度(OD)值介于1.80～2.10，表明RNA純度高。用1.4%瓊脂糖-甲醛凝膠評估RNA完整性。使用含RNA酶的TaKaRa反轉錄試劑盒將總RNA(1 μg)反轉錄成cDNA。

1.7 引物的合成和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Primer Premier 6.0軟件設計目的基因和內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物，并進行BLAST比對。本研究中使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列參見Liu等[7]。使用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)對目的基因和GAPDH進行定量。qRT-PCR在20 μL反應體系中進行，含有2 μL cDNA，0.8 μL引物(反應中最終引物濃度為0.4 μmol/L)和SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa公司，日本)作為熒光染料。反應條件如下：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。所有樣品設3個重復。目的基因的mRNA相對表達量計算參照Niwińska等[21]的2-△△Ct方法。

1.8 數據分析

使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。使用GraphPad Prism 6進行繪圖。

2 結 果

2.1 不同濃度的丁酸鈉對瘤胃上皮細胞周期的影響

如圖2所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，G0/G1期和S期細胞比例呈二次變化(P<0.05)。0和8 mmol/L丁酸鈉組G0/G1期細胞比例顯著高于2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著高于0 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，而2 mmol/L丁酸鈉組顯著高于4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。4 mmol/L丁酸鈉組S期細胞比例顯著高于0、2和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著低于2 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。隨著丁酸鈉濃度的升高，G2/M期細胞比例呈線性降低(P<0.05)，8 mmol/L丁酸鈉組顯著降低于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。

2.2 不同濃度的丁酸鈉對瘤胃上皮細胞Cyclin和CDK mRNA相對表達量的影響

如圖3所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細胞CyclinA2和CDKⅠ的mRNA相對表達量呈線性降低(P<0.05)。8 mmol/L丁酸鈉組的CyclinA2 mRNA相對表達量顯著低于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，8 mmol/L丁酸鈉組的CDKⅠ mRNA相對表達量顯著低于0和2 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6 mRNA相對表達量呈二次變化(P<0.05)。2和4 mmol/L丁酸鈉組的CyclinDⅠ mRNA相對表達量顯著高于0和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著低于0 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)；4 mmol/L丁酸鈉組的CDK4 mRNA相對表達量顯著高于0、2和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)；2和4 mmol/L丁酸鈉組的CDK6 mRNA相對表達量顯著高于8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。不同濃度的丁酸鈉對羔羊瘤胃上皮細胞CyclinBⅠ、CyclinEⅠ和CDK2 mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)。

數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 不同濃度的丁酸鈉對瘤胃上皮細胞凋亡相關基因mRNA相對表達量的影響

如圖4所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和B淋巴細胞瘤-2相關的X蛋白(Bax)mRNA相對表達量呈線性升高(P<0.05)。8 mmol/L丁酸鈉組的Caspase-3和BaxmRNA相對表達量顯著高于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。不同濃度的丁酸鈉對羔羊瘤胃上皮細胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(Caspase-8)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2/BaxmRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)。

Cyclin A2：細胞周期蛋白 cyclin protein A2；Cyclin B1：細胞周期蛋白 cyclin protein B1；Cyclin D1：細胞周期蛋白 cyclin protein D1；Cyclin E1：細胞周期蛋白 cyclin protein E1；CDK1：細胞周期蛋白依賴性激酶1 cyclin dependent protein kinases 1；CDK2：細胞周期蛋白依賴性激酶2 cyclin dependent protein kinases 2；CDK4：細胞周期蛋白依賴性激酶4 cyclin dependent protein kinases 4；CDK6：細胞周期蛋白依賴性激酶6 cyclin dependent protein kinases 6。圖6同 The same as Fig.6.

Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 cysteinyl aspartate specific proteinase-3；Caspase-8：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8 cysteinyl aspartate specific proteinase-8；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2 B-cell lymphoma-2；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關的X蛋白 B-cell lymphoma-2-associated X protein；Bcl-2/Bax：B淋巴細胞瘤-2/B淋巴細胞瘤-2相關的X蛋白 B-cell lymphoma-2/B-cell lymphoma-2-associated X protein。圖7同 The same as Fig.7.

2.4 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA相對表達量和細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度的影響

如圖5所示，丁酸鈉組的瘤胃上皮細胞IGF-ⅠRmRNA相對表達量和細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度顯著高于對照組和抑制劑組(P<0.05)，但是對照組和抑制劑組之間IGF-ⅠRmRNA相對表達量和細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度無顯著差異(P>0.05)。各組瘤胃上皮細胞IGF-Ⅰ mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖5 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA

2.5 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞Cyclin和CDK mRNA相對表達量的影響

如圖6所示，丁酸鈉組瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ和CDK4 mRNA相對表達量顯著高于對照組和抑制劑組(P<0.05)。各組瘤胃上皮細胞CyclinA2、CyclinBⅠ、CyclinEⅠ、CDKⅠ、CDK2和CDK6 mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞凋亡相關基因mRNA相對表達量的影響

2.6 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞細胞凋亡相關基因mRNA相對表達量的影響

如圖7所示，各組瘤胃上皮細胞Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax和Bcl-2/BaxmRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

反芻動物瘤胃上皮細胞的生長發育與細胞周期的變化密切相關。細胞周期的1個或多個階段的變化最終影響細胞的產生速率和最終的轉化時間[22]。細胞周期的每個階段(G0期、G1期、S期、G2期和M期)由Cyclin和CDK的活性控制[23]。Cyclin A2參與S期DNA復制的起始和完成[24]。從G1期進入S期，Cyclin EⅠ替代Cyclin A2和CDK2起作用[25]。Cyclin A2-CDK2復合物通過磷酸化驅動染色質濃縮對DNA復制具有重要作用[26]。Cyclin結合并激活其伴侶CDK，然后活性激酶使細胞內的大量蛋白質底物磷酸化以改變蛋白質的活性，調節mRNA的轉錄和翻譯[8]，使細胞周期能夠順利進行；如果有細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)降低活性激酶的活性，那么Cyclin-CDK復合物的形成受到阻礙，阻止細胞周期的正常變化。Cyclin DⅠ、Cyclin D2、Cyclin D3及Cyclin E在G1期達到其合成和活性的高峰，調節細胞從G1期過渡到S期，保證細胞的增殖過程，而抑制Cyclin的表達會延長細胞停留在G1期的時間，從而減少細胞的增殖[27]。同時，瘤胃上皮的發育也與細胞凋亡的變化密切相關，也是瘤胃上皮發育的重要組成部分，細胞凋亡進程主要受Bcl-2和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)家族調控[28-30]。據報道，通過灌服丁酸鈉可以調控IGF-Ⅰ濃度來調控上皮細胞增殖的基因表達[7]。有研究表明，IGF-Ⅰ通過改變Cyclin DⅠ蛋白的表達來調節Cyclin DⅠ-CDK4復合物的合成，推動細胞周期運轉[31]；在缺乏血清的情況下，添加IGF-Ⅰ可誘導細胞周期停滯的成纖維細胞Cyclin DⅠ蛋白表達，細胞周期恢復正常運轉[19]。所以羔羊灌服一定量的丁酸鈉可能通過IGF-Ⅰ信號通路間接地調控瘤胃上皮細胞增殖。

圖7 丁酸鈉對IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細胞凋亡相關基因mRNA相對表達量的影響

本文體外細胞試驗結果發現，8 mmol/L的丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細胞24 h，增加了細胞周期G0/G1期的細胞比例，降低了細胞周期S期和G2/M期的細胞比例，同時下調了瘤胃上皮細胞CyclinA2、CyclinDⅠ和CDK6的表達，上調了凋亡基因Caspase-3和Bax的表達。以上結果說明高濃度的丁酸鈉有抑制細胞增殖的作用。同時，Gabel等[32]研究表明，當灌服丁酸鈉濃度較高時，瘤胃上皮細胞的增殖在某一時刻停止，而細胞的分化程度增加。Baldwin等[33]研究表明，在持續灌服丁酸鈉168 h后，上調了與細胞分化相關的基因表達，同時下調了與瘤胃上皮細胞增殖相關的基因表達。與使用8 mmol/L丁酸鈉相比，使用2和4 mmol/L丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細胞24 h，上調了瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6的表達，且4 mmol/L丁酸鈉的作用優于2 mmol/L丁酸鈉。CyclinDⅠ、CDK4和CDK6是G1期重要的Cyclin和相關依賴性激酶，推動細胞周期G1期到S期的過渡[8]。同時，本研究發現使用2和4 mmol/L丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細胞24 h，降低了細胞周期G0/G1期的細胞比例，增加了S期的細胞比例，此結果與上調瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6表達的結果相一致。上述結果說明較低濃度的丁酸鈉具有加速細胞周期G1期到S期的過渡、推動細胞周期進程、促進瘤胃上皮細胞增殖的作用。彭志鵬等[34]研究也表明，低濃度丁酸可以促進體外培養瘤胃上皮細胞的生長，而高濃度的丁酸作用則相反。Gabel等[32]研究表明，高濃度丁酸可能會造成細胞分化和抑制上皮細胞增殖。Liu等[35]研究表明，5 mmol/L丁酸鈉處理瘤胃上皮細胞對細胞周期階段沒有顯著影響，而8、10和20 mmol/L丁酸鈉處理增加了細胞周期G0/G1期的細胞比例，降低了S期和G2/M期的細胞比例，隨著丁酸鈉濃度的增加，這種作用越來越明顯。上述體外細胞試驗研究表明，不同濃度的丁酸鈉對瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的作用不同，為了更具體研究丁酸鈉的促生長作用機制，試驗中篩選4 mmol/L丁酸鈉繼續培養瘤胃上皮細胞。但是加入丁酸鈉和IGF-ⅠR抑制劑明顯下調了CyclinDⅠ和CDK4 mRNA相對表達量，說明IGF-ⅠR抑制劑可能阻斷了IGF-Ⅰ信號通路，IGF-Ⅰ不能與受體結合激活相應酶類，進一步說明IGF-Ⅰ信號通路對羔羊瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的影響。

目前體內研究發現，羔羊瘤胃乳頭大小和表面積的增加證實了IGF-Ⅰ對瘤胃生長發育的促進作用[36-38]。在丁酸鈉灌服促進羔羊瘤胃發育的同時，羔羊血漿IGF-Ⅰ濃度顯著提高，也上調了瘤胃上皮IGF-ⅠR和胰島素樣生長因子結合蛋白-5(IGFBP-5)的表達[7]。再次證實丁酸鈉可能是通過調控內源IGF-Ⅰ的分泌，進而通過IGF-Ⅰ信號通路來調控羔羊瘤胃上皮細胞增殖和凋亡。在正常情況下，當IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR結合后，其酪氨酸和絲氨酸殘基發生自身磷酸化反應，IGF-ⅠR的活化可以激活胰島素受體底物-Ⅰ(IRS-Ⅰ)、胰島素受體底物-2(IRS-2)、同源性和膠原蛋白(SHC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等多種底物，這些底物的活化啟動了不同的細胞信號轉導通路，分別介導有絲分裂、細胞的增殖分化和抑制細胞凋亡等生物學功能[39-42]。本試驗中通過PPP來抑制IGF-ⅠR的活性，PPP是一種常用的IGF-ⅠR抑制劑，可以與IGF-Ⅰ競爭性結合IGF-ⅠR達到抑制其活性的作用[38]。為了具體驗證IGF-Ⅰ信號通路在丁酸鈉調控瘤胃上皮細胞增殖和凋亡過程中的作用，在加入4 mmol/L丁酸鈉前1 h，通過加入IGF-ⅠR抑制劑來抑制IGF-Ⅰ信號通路，進而觀察丁酸鈉對瘤胃上皮細胞增殖的作用。本研究發現，雖然4 mmol/L丁酸鈉處理對IGF-Ⅰ的mRNA相對表達量無顯著影響，但4 mmol/L丁酸鈉處理升高了細胞液中IGF-Ⅰ濃度，上調了瘤胃上皮細胞IGF-ⅠR的mRNA相對表達量，而添加PPP抑制了瘤胃上皮細胞IGF-ⅠR、CyclinDⅠ和CDK4的mRNA相對表達量，并且降低了細胞培養液中IGF-Ⅰ濃度。這說明添加一定濃度的丁酸鈉增加了IGF-Ⅰ的合成，并且推動瘤胃上皮細胞周期進程，促進瘤胃上皮細胞增殖[43]；而4 mmol/L丁酸鈉處理的瘤胃上皮細胞IGF-Ⅰ的mRNA相對表達量無顯著差異，說明本試驗的樣品收集時間點可能存在缺陷，在今后的試驗中需要增加樣品收集的時間點。一定濃度的IGF-Ⅰ可誘導細胞周期停滯的成纖維細胞Cyclin DⅠ蛋白表達和Cyclin-CDK4復合物合成，促進其與CDK4異二聚體化，加快細胞周期從G1期到S期的轉變，并增加瘤胃上皮細胞的DNA合成量[44]。所以細胞液中較高濃度的IGF-Ⅰ是促進瘤胃上皮細胞發育的重要因素[18]。本試驗研究表明，抑制IGF-ⅠR能夠有效阻斷丁酸鈉對瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ和CDK4的mRNA表達及對細胞增殖的促進作用。所以IGF-Ⅰ必須與IGF-ⅠR結合以后才能上調瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ的表達，促進其與相應的CDK4形成復合物，從而加速細胞周期進程，促進細胞增殖[37]。Sell等[45]研究發現，當小鼠IGF-ⅠR基因敲除后，體外培養的成纖維細胞即使在培養基中添加再多的胎牛血清，其增殖速度仍遠低于正常細胞水平，延長了細胞周期的運轉時間；血清饑餓法能使成纖維細胞的細胞周期停滯在G0/G1期，而添加IGF-Ⅰ后，細胞能夠重新進入S期，恢復細胞周期正常運轉，但對缺失IGF-ⅠR基因的小鼠則沒有這種影響?？傊?，IGF-ⅠR是IGF-Ⅰ發揮促進細胞增殖作用的關鍵，只有兩者結合才能發揮促進作用。

在本試驗條件下，添加IGF-ⅠR抑制劑抑制了丁酸鈉對羔羊瘤胃上皮細胞的增殖作用。而IGF-Ⅰ信號通路只有把細胞外的信號傳導至細胞內才能對其靶細胞發揮一系列調控功能[39-42,46]。目前公認的IGF-Ⅰ信號轉導途徑有3條：Ras/Raf/絲裂原激活蛋白激酶(MEK)/胞外信號調節激酶(ERK)信號轉導途徑、PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號轉導途徑和14-3-3蛋白/Raf信號轉導途徑。其中，Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號轉導途徑與細胞增殖有關，然而14-3-3蛋白/Raf信號轉導途徑主要通過鈍化凋亡蛋白(BAD)來抑制細胞凋亡，而IGF-Ⅰ激活細胞膜上的IGF-ⅠR就是通過經典的Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導途徑來調節細胞增殖[14]。據Arunee等[47]報道，體外添加IGF-Ⅰ促進小鼠視網膜色素上皮細胞受體輔助因子(c-Raf)和ERK磷酸化，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導途徑，加快細胞周期G1期進程；相反，不論是否添加IGF-Ⅰ，只要Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導途徑被阻斷則導致細胞周期停滯。盧勁曄[19]研究表明，體外添加IGF-Ⅰ提高ERK磷酸化水平，而當ERK抑制劑抑制ERK磷酸化，則添加IGF-Ⅰ對瘤胃上皮細胞CyclinDⅠ表達的促進作用也被抑制。但是IGF-Ⅰ通過結合IGF-ⅠR激活Ras/Raf/MEK/ERK信號傳導途徑來提高羔羊瘤胃上皮細胞周期G1期CyclinDⅠ和CDK4的mRNA相對表達量，同時降低Caspase-3的mRNA相對表達量的具體機理還有待進一步研究。

4 結 論

① 體外培養細胞中添加2和4 mmol/L的丁酸鈉可促進羔羊瘤胃上皮細胞增殖，而添加8 mmol/L的丁酸鈉具有抑制細胞增殖、加快細胞凋亡的作用，說明較低濃度的丁酸鈉可促進體外培養瘤胃上皮細胞的生長，而高濃度的丁酸鈉作用則相反。

② IGF-Ⅰ信號通路在丁酸鈉促進瘤胃上皮細胞發育的過程中具有重要作用，一定濃度的丁酸鈉可以促進IGF-Ⅰ的分泌，IGF-Ⅰ與IGF-ⅠR結合后，推動細胞從G1期過渡到S期，進而促進瘤胃上皮細胞增殖。