血根堿通過核轉錄因子-κB信號通路減輕脂多糖誘導的仔豬小腸黏膜上皮細胞炎癥反應

高 歡 蔣曉旭* 楊玉婷 冉津銘 沈麗艷 蔣恒鑫 李雪艷 林秋葉 蔣慶文 曹振輝** 潘洪彬**

(1.云南農業大學動物科學技術學院，云南省動物營養重點實驗室，昆明650201；2.達州職業技術學院，達州635000；3.云南農業大學香料研究所，昆明650201)

養豬業在我國農業產業經濟中占據主導地位[1]。仔豬是現代化養豬生產的核心，其健康狀況對后期的生長發育具有極其重要的影響[2]。其中，腸道健康是仔豬生長發育和快速生長的基礎[3]。天然植物及其提取物作為飼料添加劑具有來源天然和不易產生耐藥性的特點，同時又具有促進畜禽生長、提高免疫力、抗應激、改善腸道健康的作用。

博落回可用于治療疥癬、陰道滴蟲及殺蟲滅蛆等，最早記載于唐人陳藏器撰寫的《本草拾遺》中[4]。從博落回中分離得到的血根堿(sanguinarine，SG)是一種苯菲啶異喹啉生物堿，具有抗炎、抑菌、提高機體免疫力、改善腸道健康等功能[5-7]。SG作為飼料添加劑可部分替代抗生素，且SG的吸收快、分布快、代謝快，生物利用度較低，機體殘留量少[8-10]。研究發現SG使雞小腸中CD3細胞數量減少，黏膜損傷減輕，從而有助于預防腸道細菌感染[11]。肉雞飼糧中添加SG可提高肉雞的生長性能[12]。斷奶仔豬飼糧中添加SG可提高仔豬空腸和回腸絨毛高度，改善腸黏膜形態，提高小腸黏膜免疫功能，從而提高仔豬的平均日增重和平均日采食量[13-14]。

核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是細胞核內重要的核轉錄因子，它在許多細胞刺激介導的細胞信息轉錄調控中起核心作用。NF-κB家族的轉錄亞基包括p65、p50、p52、RelB和c-Rel，所有成員間可形成同源或異源二聚體，在細胞中主要以p50/p65二聚體形式存在，其中p65亞基含有轉錄激活結構域[15-16]。NF-κB介導的信號通路參與體內多種反應過程，被認為是經典的炎癥相關信號通路[17]。目前，SG影響仔豬腸道炎癥的作用機制尚不清楚。因此，本研究提出SG通過NF-κB信號通路調控仔豬小腸黏膜上皮細胞(IPEC-J2細胞)抗炎功能的設想，旨在闡明SG通過抑制NF-κB信號通路減輕IPEC-J2細胞炎癥的分子機制，以期為SG作為豬用飼料添加劑調控仔豬腸道健康提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

SG，分子式為C20H14NO4，相對分子質量為332.33，含量為99.7%，購自上海源葉生物科技有限公司；IPEC-J2細胞購自北納創聯生物技術研究院；過硫酸胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胰蛋白酶購自Biological公司；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購自上海羽朵生物有限公司；核轉錄因子-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α、p65、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)抗體購自Cell Signaling Technology公司；β-肌動蛋白(ACTB)購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計與分組

首先采用單因素試驗設計，研究SG對IPEC-J2細胞促生長作用的適宜濃度和時間以及構建IPEC-J2細胞致炎模型LPS的適宜濃度和時間。首先，以不同濃度(0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL)SG處理IPEC-J2細胞24 h，研究其對IPEC-J2細胞活性的影響；并進一步研究0.500 μg/mL SG下不同時間(0、8、16、24、32、40 h)對IPEC-J2細胞活性的影響。其次，以不同濃度(0、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL)LPS處理IPEC-J2細胞24 h，研究其對IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-6、IL-8含量的影響；并進一步研究5.0 μg/mL LPS下不同時間(1、3、6、9、12 h)對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-8含量的影響。

在確定SG對IPEC-J2細胞的適宜濃度、時間和構建LPS對IPEC-J2細胞致炎模型的基礎上[18-20]，分別檢測對照組(無添加)、LPS致炎模型細胞組(LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h)和適宜濃度SG+LPS致炎模型細胞組(SG+LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h和0.500 μg/mL SG處理24 h)在NF-κB信號通路中相關基因和蛋白表達及其產物含量。

1.2.2 IPEC-J2細胞培養

IPEC-J2細胞采用含5 mL培養基(含0.1%青鏈霉素抗體、10%FBS和90%DMEM高糖培養基)的培養皿(25 cm2)培養于37 ℃、5%的CO2培養箱，2 d傳代1次。

1.2.3 細胞活性檢測

臺盼藍染色計數法：取對數生長期的IPEC-J2細胞，PBS清洗2～3次，胰蛋白酶消化4～6 min；加入含血清與雙抗的培養基3～4 mL懸浮細胞，充分混勻，靜置待用；取200 μL的細胞液和200 μL的臺盼藍進行充分混勻，混合液靜置；使用細胞計數板前需用酒精棉球進行清理，取10 μL的混合液打入細胞計數板，選取細胞計數板上四個角的方格進行計數，并取平均值。

1.2.4 引物設計與合成

根據GenBank中豬的ACTB、IL-8、IL-6、核轉錄因子-κB1(NF-κB1)、核轉錄因子-κB2(NF-κB2)、RelB、核轉錄因子-κB亞基1(NF-κB1A)、核轉錄因子-κB激酶抑制劑ε(IKKε)、腫瘤壞死因子-α誘導蛋白3(TNFAIP3)相關基因序列信息，利用Primer Premier 5.0設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

1.2.5 mRNA表達量測定

實時熒光定量PCR體系見表2。實時熒光定量PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃變性30 s，反應40個循環。

表2 實時熒光定量PCR體系

1.2.6 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試驗

按照IL-6、IL-8和TNF-α的ELISA檢測試劑盒操作步驟進行檢測。

1.2.7 蛋白質免疫印跡(Western Blot)

分別提取IPEC-J2細胞總蛋白、胞漿蛋白和核蛋白。采用10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白。濕轉法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將膜用TBS-吐溫20(TTBS)中漂洗，漂洗后用5%脫脂奶封閉1 h。分別用IκBα、p65一抗4 ℃孵育過夜，ACTB作為內參，選用HRP標記的羊抗鼠抗體4 ℃孵育2 h，暗室曝光顯影。

1.3 統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較，各組數據以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 SG對IPEC-J2細胞活性的影響

2.1.1 不同濃度SG對IPEC-J2細胞活性的影響

由圖1可見，1.000和2.000 μg/mL的SG處理IPEC-J2細胞24 h，細胞明顯皺縮和死亡(圖1-E～圖1-F)，0～0.500 μg/mL的SG處理IPEC-J2細胞24 h后細胞形態無明顯變化(圖1-A～圖1-D)。由表3可見，2和4倍稀釋條件下，與0 μg/mL SG組相比，1.000和2.000 μg/mL SG組的細胞數量顯著或極顯著減少(P<0.01)，0.500 μg/mL SG組細胞數量極顯著增加(P<0.01)。

2.1.2 0.500 μg/mL SG處理不同時間對IPEC-J2細胞活性的影響

由表4可見，與0 h時相比，IPEC-J2平均細胞數量在16、24、32、40 h時極顯著升高(P<0.01)，且在24 h時達到最高值。

A～F的SG濃度分別為：0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL。

2.2 LPS對IPEC-J2細胞IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清中IL-6、IL-8含量的影響

2.2.1 不同濃度LPS對IPEC-J2細胞IL-6、IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-6、IL-8含量的影響

由圖2可見，與0 μg/mL LPS組相比，1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL LPS組IPEC-J2細胞IL-6 mRNA相對表達量極顯著上調(P<0.01)，1、5、25 μg/mL LPS組IL-8 mRNA相對表達量顯著或極顯著上調(P<0.05或P<0.01)，且5 μg/mL LPS組IL-6、IL-8 mRNA相對表達量最高。不同濃度LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量均高于對照組，5 μg/mL LPS組細胞上清液中IL-6和IL-8含量極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.2.2 5 μg/mL LPS處理不同時間對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量的影響

由圖3可見，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1、3、6 h的IL-8 mRNA相對表達量均極顯著高于0 h(P<0.01)，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h時細胞上清液中IL-8含量極顯著高于0 h(P<0.01)，且5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h時IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量最高。

表3 不同濃度SG對IPEC-J2細胞24 h活性的影響

表4 0.5 μg/mL的SG在不同時間對IPEC-J2細胞活性的影響

2.3 SG對IPEC-J2細胞NF-кB信號通路的影響

2.3.1 SG對IPEC-J2細胞NF-кB信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

由圖4可見，與對照組相比，LPS組細胞中IL-6、IL-8、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1、RelBmRNA相對表達量均極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞中IL-6、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1 mRNA相對表達量均極顯著降低(P<0.01)，IL-8 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖3 5 μg/mL LPS處理不同時間對IPEC-J2細胞IL-8 mRNA相對表達量和細胞上清液中IL-8含量的影響

圖4 SG對IPEC-J2細胞NF-κB信號通路相關基因mRNA相對表達量的影響

2.3.2 SG對IPEC-J2細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量的影響

由圖5可見，與對照組相比，LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量均極顯著升高(P<0.01)，細胞上清液中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞上清液中IL-6、IL-8含量顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖5 SG對IPEC-J2細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量的影響

2.3.3 SG對IPEC-J2細胞中p65和IκBα蛋白表達量的影響

2.3.3.1 SG對IPEC-J2細胞總蛋白中p65和IκBα蛋白表達量的影響

由圖6可見，與對照組相比，LPS組細胞總蛋白中IκBα、p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞總蛋白中的IκBα蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。

2.3.3.2 SG對IPEC-J2細胞核蛋白中p65蛋白表達量的影響

由圖7可見，與對照組相比，LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 SG對IPEC-J2細胞總蛋白中p65、IκBα蛋白表達量的影響

圖7 SG對IPEC-J2細胞核蛋白中p65

2.3.3.3 SG對IPEC-J2細胞胞漿蛋白中p65蛋白表達量的影響

由圖8可見，與對照組相比，LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達量極顯著升高(P<0.01)。

圖8 SG對IPEC-J2細胞胞漿蛋白中p65

3 討 論

博落回提取物的主要有效成分SG早在1999年經農業部批準可作為飼用添加劑[21]。以SG為主要成分的博落回提取物開發注冊為二類新中獸藥[(2011)新獸藥證字34號)]，并獲得了獸藥添字批準文號[獸藥添字(2012)180415250]，2019年12月農業農村部組織修訂的《藥物飼料添加劑品種目錄及使用規范》依然將博落回提取物作為藥物飼料添加劑使用，成為飼料添加劑抗生素替代產品之一[22]。博落回提取物主要有效物質SG顯著影響豬的增重、飼料轉化率[23]，其與益生菌聯合應用具有預防肉雞壞死性腸炎的作用[24]。SG具有抑菌、抗炎、促生長、抗寄生蟲等多種生物活性，適用于雞、豬、魚的健康養殖，對我國養殖業和國民食品安全具有重要意義[7,25-26]。

SG在體內外均有明顯的抗炎作用，可減輕豬腸黏膜損傷，有助于預防腸道細菌感染[27]，同時SG具有減少仔豬腸上皮細胞的水分流失和/或增強腸道水分和營養素吸收的功能[28]。研究發現，高濃度的SG對于細胞生長具有抑制作用，SG終濃度為5～10 μmol/L時可明顯降低人乳腺癌MCF-7細胞存活率，并升高細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8、Caspase-9活性[29]。通過SG對IPEC-1細胞增殖影響的研究表明，0.25～4.00 μg/mL的SG對IPEC-1細胞的增殖有顯著的抑制作用；而0.006 25～0.100 000 μg/mL的SG對IPEC-1細胞的增殖具有顯著的促進作用，由此可見，低濃度的SG具有促進IPEC-1細胞增殖的作用[30]。本研究以0.5 μg/mL SG處理IPEC-J2細胞24 h后細胞數量達到最高值，表明SG對IPEC-J2細胞促生長作用的適宜濃度和時間分別為0.500 μg/mL和24 h。該結果的差異可能是不同細胞株對SG的耐受性不同所導致。

LPS作為一種典型腸毒素可引起豬產生細菌感染癥狀，是研究豬腸道炎癥反應的常用藥物[31]。本研究以5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細胞1 h，IL-8 mRNA相對表達量最高，表明構建IPEC-J2細胞致炎模型LPS的適宜濃度和時間分別為5.0 μg/mL和1 h。

NF-кB信號通路是經典的炎癥相關通路，激活后的NF-кB進入細胞核，與DNA模塊上的特異蛋白結合，指示細胞形成具有炎癥功能的蛋白復合物，最后這些蛋白激活炎癥并介導炎癥反應信號轉導[32-33]。其活化途徑是由LPS和致炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、細菌感染等觸發，細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，將侵襲信號傳遞給免疫細胞，誘導NF-κB表達增加，刺激因子產生的白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8和TNF-α等細胞因子與受體結合，信號傳導至核轉錄因子-κB抑制蛋白激酶(IKK)復合物，從而激活炎癥反應[34]。IKK復合物一旦激活，IκB在絲氨酸(Ser)32和Ser36位被磷酸化[35]，并通過26S蛋白酶體被降解，NF-κB二聚體從IκB/p50/p65復合物中解離，活化的NF-κB轉移至細胞核中，與核內多種靶基因的啟動子區結合，活化的NF-κB可調節細胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α等)、細胞黏附分子和抗原遞呈細胞表面主要組織相容性復合物-Ⅱ(MHC-Ⅱ)協同刺激因子的表達，還可刺激誘導型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase，iNOS)和其自身抑制物IкBα的表達[36]。研究表明，活化的NF-κB引起的炎癥反應最終導致腸黏膜損傷[37]。所以，NF-κB活化是引起腸道黏膜損傷的關鍵生理因子。進一步的研究發現，中國鉤吻中生物堿-鉤吻堿子可抑制NF-κB活化，從而減輕腸道炎癥反應[38]。本研究中SG+LPS組細胞中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1等mRNA相對表達量及IL-6、IL-8含量顯著或極顯著低于LPS組，表明SG通過抑制IPEC-J2細胞炎癥模型的NF-κB信號通路相關基因表達，減少IL-6、IL-8的分泌，減輕腸上皮細胞炎癥損傷，降低了IPEC-J2細胞炎癥癥狀。

在正常情況下，NF-κB位于細胞胞漿內，一般有2個功能亞單位，即p65和p50。NF-κB通常與IκB結合成無活性的形式存在于胞質中，當受氧化劑、細菌、毒素、炎癥細胞因子的刺激后被激活，經歷快速磷酸化后IκB被非特異性蛋白酶水解，從而使p65蛋白的核定位信號暴露，導致NF-κB快速向細胞核轉移，結合在被誘導基因啟動子序列上與之相同的κB位點，啟動基因的轉錄和相應蛋白質的合成[39]。因此，p65蛋白的核轉移是NF-κB活化的重要前提與關鍵步驟。研究發現，SG是NF-κB活化、IκBα磷酸化和降解的抑制劑[40]，同時p65、p50等亞基蛋白的核轉移有利于NF-κB的激活與炎癥的發展[18]。本研究顯示，與對照組相比，LPS組細胞總蛋白中IκBα蛋白表達量極顯著降低，可能是因為IκBα發生了磷酸化，細胞核蛋白中p65蛋白表達量顯著增加和胞漿中p65蛋白表達量極顯著減少，提示LPS使NF-κB激活從而促進p65的核轉移；與LPS組相比，SG+LPS組細胞核蛋白中p65蛋白表達量極顯著下降，細胞胞漿蛋白中p65和細胞總蛋白中IκBα蛋白表達量極顯著升高，說明SG抑制了p65核轉移，降低IκBα磷酸化，進而抑制LPS致炎IPEC-J2細胞的NF-κB信號通路活化來降低炎癥的表達。

4 結 論

SG可通過下調NF-κB信號通路中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1、NF-κB2、TNFAIP3、IL-6、IL-8的表達，減少IL-6、IL-8的分泌，進而增強IPEC-J2細胞的抗炎能力；SG上調LPS致炎IPEC-J2細胞總蛋白中IκBα和胞漿蛋白中p65的蛋白表達，降低細胞核蛋白中p65的蛋白表達，抑制了p65向細胞核內轉移，進而抑制NF-κB信號通路活化，減輕IPEC-J2細胞的炎癥反應。