添加乳酸菌劑和糖蜜對不同含水量食葉草青貯發酵品質及體外干物質消失率的影響

周 昕 黃秋連 王 健 張嘉賓 曹 陽

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室，大慶163319)

食葉草(Rumexhanusby.)是一種多年生宿根草本植物，又因蛋白質含量高被稱為蛋白草[1-2]，其具有生長速度快、再生能力強、產草量高、草質優良等特點，可有效緩解飼料供應不足等問題。食葉草含有動物所需的維生素E、礦物質和氨基酸等[3]，其根、莖、葉中含有的活性物質可以促進新陳代謝，提高免疫力。飼喂食葉草有增加畜禽食欲、增強體質、促進生長、降低養殖成本等優勢[4]，所以食葉草可作為優質蛋白質飼料新資源。

食葉草含水量較高，碳水化合物含量較低，調制干草比較困難，干燥時間長，很容易腐爛變質。為延長食葉草貯藏時間，減少營養成分損失，調制青貯是比較可行的方法。青貯飼料的發酵品質受青貯原料、水分含量、溫度及有益發酵菌等的影響[5]。乳酸菌作為青貯發酵中的有益菌，可降低pH，抑制有害菌繁殖。但是牧草表面的乳酸菌一般較少，因此在制作青貯時常通過添加乳酸菌來增加其表面的乳酸菌數量，促進乳酸發酵，提高青貯飼料的發酵品質[6]。糖蜜富含碳水化合物，青貯過程中添加糖蜜可增加乳酸菌的發酵底物，加速青貯飼料的發酵進程[7]。目前人們對食葉草的整體認識和飼料開發利用研究較少，提供食葉草優質青貯調制技術的報道也有限。因此，本研究以食葉草青貯為研究對象，探究添加乳酸菌和糖蜜對不同含水量食葉草青貯發酵品質及體外干物質消失率(IVDMD)的影響，以期確定青貯時食葉草適宜的含水量，為開發優質牧草資源、合理青貯食葉草提供數據支持和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料食葉草由黑龍江某農業科技有限公司提供，其營養成分含量見表1。3種乳酸菌劑由日本國立草地研究所提供，分別為Master-LP[含有植物乳桿菌(Laobacillusplantarum)SBS0001-S菌株和SBS0003菌株]、Master-AC(含有LaobacillusplantarumSBT2300菌株)、Chikuso-1[含有干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)FG1菌株]，均由日本某種苗株式會社生產，活菌數為109CFU/g。糖蜜購自成都某商貿有限公司，總糖(蔗糖+還原糖)含量≥40%。

表1 食葉草營養成分含量

1.2 試驗設計

試驗采用雙因素(含水量×添加劑)完全隨機試驗設計，食葉草原料切碎至2～3 cm，分別給予8、12、16 h的晾曬處理，使其含水量分別為65%、60%和55%，對以上3種含水量的青貯原料分別進行添加乳酸菌劑Master-LP(LP)、乳酸菌劑Chikuso-1(LAB-1)、乳酸菌劑Master-AC(AC)、糖蜜(M)和無添加(C，對照)處理。參照Cao等[8]的試驗結果，糖蜜的添加量為4%。乳酸菌劑的添加：將菌粉與無菌水以1∶400的比例混合配制成菌液，并以菌液形式按1∶100的比例添加于青貯原料中，即菌劑最終添加量為0.002 5%。各添加劑的添加量均為鮮重基礎。以上各處理分別稱重200 g，裝入聚乙烯包裝袋(160 mm×250 mm)中進行真空密封包裝，每個處理設定3個重復，室溫[(24±2) ℃]條件下貯藏30 d后取樣，測定相關指標。

1.3 指標測定

1.3.1 感官品質評定

參照青貯飼料質量評定標準[9]，對開袋后的食葉草青貯樣品從顏色、氣味、質地及有無霉變等方面進行感官品質評定。

1.3.2 常規營養成分測定

將食葉草和開袋后的食葉草青貯樣品置于電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9240B型，上海森信實驗儀器有限公司)中65 ℃烘至恒重后，采用微型植物破碎機(FZ-102型，臨沂正衡華玻儀器有限公司)粉碎至0.5 mm備用。參照AOAC(1990)[10]方法，采用電熱恒溫鼓風干燥箱測定干物質(DM)含量，采用自動凱氏定氮儀(K1100F，濟南海能儀器股份有限公司)測定粗蛋白質(CP)含量，采用馬弗爐(SX2-4-10，天津中環實驗電爐有限公司)測定有機物(OM)含量，采用索氏提取器測定粗脂肪(EE)含量，采用蒽酮-硫酸比色法[11]測定可溶性碳水化合物(WSC)含量，參照Van Soest等[12]的方法，采用纖維分析儀(ANKOM A200i，北京安科博瑞科技有限公司)測定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。

1.3.3 微生物數量分析

采用平板計數法對食葉草青貯中乳酸菌、芽孢桿菌、好氧性細菌、酵母菌、大腸桿菌、丁酸梭菌、霉菌進行計數[13]。適當稀釋倍數后產生30～300個菌落的情況下，計數菌落，并用每克鮮重中菌落形成單位的對數表示菌落數[lg(CFU/g FM)]。取10 g食葉草青貯置于裝有90 mL無菌蒸餾水的樣品袋中，利用均質器(BAGMIXER-400W，Interscience，法國)均質90 s，并進行連續梯度稀釋。每份浸提液取20 μL，滴加到提前預備的培養基上。乳酸菌和丁酸梭菌分別使用MRS Ager培養基和Differential Reinforced Clostridial Agar培養基(青島海博生物科技有限公司)，置于厭氧培養箱(30 ℃，48 h)培養并計數。酵母菌和霉菌使用Potato Dextrose Ager培養基(通過菌落外觀和細胞形態將酵母菌與霉菌或細菌區分開來)、大腸桿菌使用Blue Light Broth Agar培養基(Nissui Ltd.，日本)、芽孢桿菌和好氧性細菌使用Standard Method Ager培養基(Nissui Ltd.，日本)，置于恒溫培養箱(30 ℃，48 h)培養并計數。培養芽孢桿菌和丁酸梭菌前，需將浸提液75 ℃水浴15 min。

1.3.4 發酵品質測定

取20 g食葉草青貯樣品置于聚乙烯袋中，加入180 mL滅菌蒸餾水，用均質器拍打90 s直至充分混勻[14]。用便攜式pH計(FG2-FK型，上海巴玖實業有限公司)測定浸提液的pH。取部分浸提液進行過濾，濾液經高速冷凍離心機(6 500×g，4 ℃)離心5 min，再經0.22 μm濾膜過濾。參照Cao等[15]的方法，采用LC-100高效液相色譜儀測定乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)及丁酸(BA)含量。

1.4 體外培養

1.4.1 試驗動物飼養管理

選擇2頭體況良好、體重(30.0±1.3) kg、安裝永久性瘤胃瘺管的綿羊作為體外瘤胃液供體動物，其所飼喂的飼糧組成(風干基礎)為：羊草70.00%，豆粕9.02%，玉米8.21%，玉米蛋白粉7.43%，麥麩3.00%，磷酸氫鈣0.94%，食鹽0.40%，預混料1.00%(每千克預混料含有FeSO416 000 mg、CuSO45 200 mg、ZnSO412 000 mg、MnSO4·5H2O 10 000 mg、沸石粉256 g、CoCl2120 mg、維生素A 200 mg、維生素D3100 mg、維生素E 600 mg、KI 6 g、MgO 74 g、CaHPO4300 g)。每天06:00和18:00各飼喂1次，自由采食和飲水。

1.4.2 培養液的配制

晨飼后2 h，分別從2頭供體羊瘤胃內采集200 mL瘤胃液，經4層紗布過濾后混合，并通入CO2保證厭氧條件。參照McDougll’s buffer方法[16]配制緩沖液與培養液，并添加還原劑L-半胱氨酸鹽酸鹽和指示劑刃天青鈉鹽。緩沖液配制方法：將0.57 g KCl、9.80 g NaHCO3、9.30 g Na2HPO4·12H2O、0.47 g NaCl、0.04 g CaCl2、0.06 g MgCl2、0.25 gL-半胱氨酸鹽酸鹽(還原劑)、0.01 g刃天青鈉鹽(指示劑)溶于少量蒸餾水，再定容至1 000 mL。培養液配制：按照1∶4的比例將瘤胃液與緩沖液混合，并通入CO2保證厭氧條件，置于39 ℃水浴鍋中備用。

1.4.3 體外發酵參數測定

稱取0.5 g食葉草青貯樣品置于容量125 mL的血清瓶中(每個處理做2個平行，并預留3個血清瓶不加入青貯樣品作為空白，其他操作如常)，注入上述培養液50 mL，通入CO2排出空氣后密封，在恒溫培養振蕩搖床(39 ℃，100 r/min)中發酵48 h，將發酵瓶放置在碎冰中終止發酵，對產氣量(GP)、pH、IVDMD和揮發性脂肪酸(VFA)含量進行測定。

參照湯少勛等[17]的方法測定GP；采用便攜式pH計測定pH；通過已恒重的快速定性濾紙過濾培養物，并將之移至鋁盒于電熱恒溫鼓風干燥箱內105 ℃下烘至恒重，通過培養前后樣品失重計算IVDMD ；參照賈鵬禹等[18]的方法對瘤胃液進行處理并通過高效液相色譜儀測定VFA含量。

1.5 統計分析

數據經Excel 2010進行匯總和整理后，根據雙因素完全隨機設計模型，使用SAS 9.0統計軟件中的一般線性模型(GLM)程序進行方差分析，建立模型：

Yijl=μ+αi+βj+(α×β)ij+eijl。

式中：Yijl為食葉草青貯發酵品質指標或IVDMD；μ為總體平均值；αi為含水量i(i=1，2，3)的效應；βj為添加劑j(j=1，2，3，4，5)的效應；(α×β)ij為含水量與添加劑的互作效應；eijl為試驗誤差。

采用Tukey法比較均值的差異顯著性，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同含水量食葉草青貯前營養成分含量

不同含水量食葉草青貯前營養成分含量見表2。

2.2 發酵30 d后食葉草青貯的感官品質

由表3可知，不同含水量的食葉草青貯顏色均呈黃綠色，其中55%組顏色偏黃。5個添加劑組間感官品質基本相似，所有樣品均質地柔軟，不粘手，無霉變。

表2 不同含水量食葉草青貯前營養成分含量

表3 含水量與添加劑對食葉草青貯感官品質的影響

2.3 發酵30 d后食葉草青貯的微生物數量

由表4可知，在含水量方面，60%組和65%組乳酸菌和酵母菌數量分別顯著高于和低于55%組(P<0.05)。在添加劑方面，乳酸菌數量由高到低的順序為LP組>LAB-1組>AC組>M組>C組，各組間差異顯著(P<0.05)；LP組酵母菌數量和LAB-1組好氧性細菌數量在所有添加劑組中最低，顯著低于其他添加劑組(P<0.05)。所有樣品均未檢出大腸桿菌、霉菌和丁酸梭菌。添加劑與含水量在乳酸菌、酵母菌、好氧性細菌數量方面表現出極顯著的交互作用(P<0.01)。

表4 含水量與添加劑對食葉草青貯微生物數量的影響

2.4 發酵30 d后食葉草青貯的營養成分含量

由表5可知，在含水量方面，60%組CP、EE含量顯著高于65%組和55%組(P<0.05)，而其NDF含量顯著低于65%組和55%組(P<0.05)；55%組DM含量在3個含水量組中最高，與其他組差異顯著(P<0.05)。在添加劑方面，CP含量由高到低的順序為LP組>LAB-1組>AC組>M組>C組，各組間差異顯著(P<0.05)；EE含量由高到低的順序為LP組>LAB-1組>M組>AC組>C組，各組間差異顯著(P<0.05)；M組WSC含量和LP組NDF含量在所有添加劑組中分別最高和最低，與其他添加劑組(AC組NDF含量除外)差異顯著(P<0.05)。添加劑與含水量在CP、EE和NDF含量方面存在極顯著的交互作用(P<0.01)。

2.5 發酵30 d后食葉草青貯的發酵品質

由表5可知，在含水量方面，60%組pH和LA含量分別顯著低于和高于65%組和55%組(P<0.05)。在添加劑方面，LA含量由高到低的順序為LP組>LAB-1組>AC組>M組>C組，各組間差異顯著(P<0.05)；與C組相比，LP組、LAB-1組、AC組、M組AA和PA含量略有下降(P>0.05)。所有樣品均未檢測出BA。添加劑與含水量在pH和LA含量方面存在極顯著的交互作用(P<0.01)。

表6 含水量與添加劑對食葉草青貯發酵品質的影響

2.6 發酵30 d后食葉草青貯的體外發酵參數

由表6可知，在含水量方面，60%組的GP和IVDMD顯著高于65%和55%組(P<0.05)。在添加劑方面，GP由高到低的順序為LAB-1組>LP組>AC組>M組>C組，C組顯著低于其他各組(P<0.05)；IVDMD由高到低的順序為LP組>LAB-1組>AC組>M組>C組，各組間差異顯著(P<0.05)。添加劑與含水量在GP和IVDMD方面表現出極顯著的交互作用(P<0.01)。

3 討 論

3.1 添加乳酸菌和糖蜜對不同含水量食葉草青貯發酵品質的影響

根據青貯飼料感官鑒定標準，優質青貯飼料呈綠色或黃綠色，酸香且莖葉柔軟，無霉變[19-20]。本試驗中添加乳酸菌和糖蜜的食葉草青貯均為優質青貯飼料。含水量是影響苜蓿青貯效果的關鍵因素之一，研究者普遍認可，適宜青貯的含水量應為60%～70%，且優質青貯飼料pH達到4.2以下[21-22]。本研究中，以含水量為60%的食葉草為青貯原料，LP組和LAB-1組食葉草青貯的pH均達到4.2以下，分別為3.97和4.19，這與Liu等[23]的研究結果一致。青貯原料含水量低時，在青貯過程中乳酸菌繁殖受到抑制，使得LA含量降低，pH下降速度變慢[24]。本研究中，食葉草青貯時添加乳酸菌顯著增加了乳酸菌數量，抑制了丁酸梭菌、霉菌等有害菌的繁殖，這與Cao等[25]的研究結果一致。王亞芳等[26]在全株玉米青貯時添加不同青貯添加劑，其中乳酸菌提升LA的能力明顯高于其他青貯添加劑。李苗苗等[27]在油莎草青貯時添加乳酸菌，顯著提高了乳酸菌數量，降低了酵母菌和好氧性細菌數量。Sheperd等[28]在苜蓿青貯時接種乳酸菌，發酵品質得以改善。高水分青貯原料含水量較高時，發酵底物被過分稀釋，不利于乳酸菌利用，但利于丁酸梭菌進行BA發酵，使青貯飼料變臭、品質變差[24]。本研究中，食葉草青貯時添加糖蜜可增加發酵底物，促進LA發酵，這與魏化敬[29]的研究結果一致。劉婷婷等[30]在“張雜谷”全株青貯時添加不同水平糖蜜和青貯添加劑，發現4%糖蜜+1.5%青貯添加劑效果最好。一般認為優質青貯飼料的BA含量應低于1%[31]，本試驗中含水量為65%、60%、55%的食葉草進行青貯后，所有樣品中均無BA，這與蔡義民等[32]的研究結果一致。本研究結果顯示，從發酵品質看，在食葉草青貯時添加乳酸菌劑比添加糖蜜效果好。生產實踐中，添加糖蜜會增加成本，所以食葉草在青貯時可使用乳酸菌劑Chikuso-1或乳酸菌劑Master-LP，以增加乳酸菌數量，改善食葉草青貯的發酵品質。

表7 含水量與添加劑對食葉草青貯體外發酵參數的影響

續表7項目Items添加劑Additive含水量 Moisture content/%656055平均值MeanSEM顯著性 SignificanceAMA×M丙酸PA/%FMC9.789.239.099.37LP10.9310.6010.2610.60LAB-110.169.869.869.96AC10.099.799.769.88M9.879.579.379.600.31NSNSNS平均值 Mean10.179.809.67丁酸BA/%FMC5.915.675.345.64LP5.965.745.745.81LAB-15.915.815.345.69AC5.985.954.955.63M5.965.914.995.620.32NSNSNS平均值 Mean5.945.825.27

3.2 添加乳酸菌和糖蜜對不同含水量食葉草青貯營養成分含量的影響

適當地降低青貯原料的含水量可以提高青貯飼料的青貯品質[33]。本研究中，60%組食葉草青貯的CP、EE含量在3個含水量組中最高，這與郭玉琴等[34]的研究結果一致。這可能是因為適當降低含水量，青貯飼料中的DM和WSC含量增加，從而促進乳酸菌的繁殖，進而改善青貯品質。以含水量為60%的食葉草作為青貯原料時，添加乳酸菌劑和糖蜜后青貯飼料中CP含量顯著升高，其中以LAB-1組的CP含量最高。陶蓮等[35]和Silva等[36]研究表明，添加乳酸菌可增加青貯飼料的CP含量。而添加糖蜜可增加青貯飼料表面可溶性糖，加速乳酸菌繁殖，這與靳思玉等[37]研究結果一致。添加糖蜜可在青貯早期增加發酵底物，使乳酸菌迅速生長，產生更多乳酸，使pH下降，蛋白酶活性得到抑制，減少蛋白質降解，從而達到改善營養價值的效果。

3.3 添加乳酸菌和糖蜜對不同含水量食葉草青貯體外發酵參數的影響

GP可反映瘤胃微生物發酵飼料的效果，是評價飼料品質的重要指標[38]。本試驗中，60%組食葉草青貯的GP顯著高于65%組和55%組，說明含水量為60%的食葉草制成的青貯飼料在瘤胃內更容易被微生物發酵，消化率更高。劉凱麗[39]在不同含水量的雜交構樹青貯時使用添加劑，發現60%含水量的雜交構樹使用添加劑的效果最好，這與本試驗研究結果一致。有研究指出，GP與瘤胃微生物對蛋白質分解能力呈正相關[40]，即GP越大，蛋白質被分解的越多。本試驗中，與無添加和添加糖蜜相比，在含水量為60%的食葉草青貯時添加乳酸菌劑使得GP顯著增加，飼料利用率更高。

3.4 含水量和添加劑對食葉草青貯品質及飼料特性的交互作用

本試驗中含水量和添加劑對pH和LA含量表現出極顯著的交互作用，可能由于高水分青貯不利于乳酸菌發酵，LA產生速率較低；低水分青貯不利于壓實，不易形成厭氧環境，抑制乳酸菌繁殖，LA產生速率下降。添加乳酸菌劑可增加青貯發酵初期乳酸菌數量，產生大量LA，迅速降低pH。

水分和添加處理對CP、EE和NDF含量表現出交互作用，可能由于高水分青貯時，壓實過程會造成汁液滲出，其營養價值大量損失；低水分青貯雖然降低了原料水分，同時也減少了WSC含量，使乳酸菌可利用的WSC減少，LA含量降低，pH下降速率減慢，不能很好地保持其營養成分。青貯時添加乳酸菌劑可降低食葉草在青貯過程中蛋白質的降解，同時產生的大量LA會酸解細胞壁，導致NDF含量降低。

含水量和添加劑對GP和IVDMD表現出極顯著的交互作用，可能是由于半干青貯和乳酸菌添加降低了青貯飼料中DM的損失，更好地保存了青貯飼料中CP和剩余的WSC，從而使其在瘤胃內得到發酵并表現出較高的GP和IVDMD。

4 結 論

本試驗條件下，不同含水量的食葉草青貯時添加乳酸菌和糖蜜均可以起到改善青貯品質，提高營養價值及IVDMD等的效果。綜合本試驗結果，在含水量為60%的食葉草青貯時添加乳酸菌劑Chikuso-1或乳酸菌劑Master-LP可使青貯品質更優。