添加乳酸菌對苜蓿青貯過程中總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性及主要黃酮苷元含量的影響

張嘉賓 李苗苗 靳思玉 王立超 周 昕 黃秋連 王 健 張愛忠 曹 陽

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室，大慶163319)

苜蓿(MedicagosativaL.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，營養豐富，常作為草食家畜重要的高蛋白質粗飼料，同時還因生物活性次級代謝產物含量高在諸多領域(醫學、美容、農業等)備受青睞[1-2]。苜蓿中含有多種生物活性物質，其中黃酮是苜蓿主要的活性成分，黃酮在植物體內以糖苷和苷元2種形式存在，其中黃酮糖苷占總黃酮含量的97%左右，黃酮糖苷作為一類大分子物質，不易滲入上皮細胞，難以被機體胃腸道直接吸收，其生物利用率相應降低。通過一定技術手段將黃酮糖苷經去糖基反應轉化為功能活性更高且可被機體直接吸收的苷元形式從而提高其利用率。研究證明，黃酮苷元具有抗炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調節脂肪代謝及雌激素樣等多種生理活性[3]。所以探索高黃酮提取率的苜蓿青貯技術，為家畜飼養提供功能性苜蓿青貯飼料、對家畜養殖中減少藥物使用、為人類提供安全健康的畜產品具有重要意義。在苜蓿青貯中乳酸菌的添加導致多種活性物含量顯著上升，包括多種游離氨基酸和多元醇[4]，乳酸菌發酵法可使黃酮類化合物結構和組分發生改變，由糖苷轉變為苷元形式[5]。多種動物試驗表明，黃酮苷元的吸收程度遠高于糖苷形式，因此結構的轉變能促進其更好地發揮抗氧化和生物活性[6]。目前國內在苜蓿黃酮糖苷脫糖基轉化成苷元方面的研究較少，主要集中于銀杏及大豆異黃酮生物轉化的研究。王洋等[7]報道，添加不同植物乳酸菌均能使苜蓿中黃酮提取率顯著提高，其中以植物乳酸桿菌的效果尤為明顯。黃酮生物轉化酶主要包括β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶[8]，目前研究最多的為β-葡萄糖苷酶，除優越的生物轉化功能外，β-葡萄糖苷酶還是重要的增香酶，它能通過催化水解芳香基和烴基原子團之間的糖苷鍵斷裂產生葡萄糖和對應配基，從而釋放芳香因子，常應用于食品工業果酒增香等[9]。因此，本試驗擬通過分析苜蓿青貯過程中發酵品質、總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性及主要黃酮苷元含量，研究添加乳酸菌對苜蓿青貯過程中總黃酮提取率的影響，分析苜蓿總黃酮提取率與發酵產物的關系，明確苜蓿青貯過程中總黃酮提取率的影響因素，探索減少苜蓿青貯中黃酮損失的青貯調制技術。

1 材料與方法

1.1 苜蓿及添加劑制備

苜蓿于初花期刈割，顏色為綠色，莖葉分明，由黑龍江省蓬勃牧草有限公司提供，預干至含水量約50%并切碎至1～2 cm作為青貯原料，其常規化學成分見表1。試驗選用的乳酸菌制劑為日本國立畜產研究所提供的植物乳桿菌Master-LP(Lactobacillusplantarum，日本雪印種苗株式會社生產)，使用方法和劑量依據其包裝說明書，青貯原料中菌劑濃度為25 mg/kg，活菌數105CFU/g以上。

表1 青貯原料常規化學成分(干物質基礎)

1.2 試驗設計

采用雙因素(添加×時間)完全隨機試驗設計，將苜蓿原料分別進行乳酸菌添加及無添加處理(對照)，添加乳酸菌是將菌粉與無菌水以1∶400比例混合制備成菌液，并以菌液形式按1∶100添加于青貯原料中，菌劑最終添加量為0.002 5%，活菌數為105CFU/mL。稱取200 g以上處理的樣品裝入聚乙烯袋(16 cm×25 cm)，使用真空包裝機(AT-620;Jodpack Co.,Ltd.,北京)真空密封，每個處理50個重復，置于避光處貯藏，貯藏溫度為(24±2) ℃，經過0、1、3、5、7、15、22、39、46、53、60、67、74 d發酵后，各處理分別開封3袋，進行相關指標的測定。

1.3 化學成分及發酵品質

根據AOAC[10](1990)中的方法，通過電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-920B,上海森信實驗儀器有限公司)測定干物質(DM)含量；茂福爐(SX2-4-10,天津中環實驗電爐有限公司)測定有機物(OM)含量；利用凱氏定氮儀(K1100F,濟南海能儀器股份有限公司)測定粗蛋白質(CP)、總氮含量；利用索氏提取器測定粗脂肪(EE)含量。中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量通過纖維分析儀(ANKOM A200i,美國安康)依據Van Soest等[11]的方法進行分析。根據馮宗慈等[12]的分光光度計法，利用紫外可見分光光度計(UV-6100A,上海元析儀器有限公司)測定氨態氮的含量。

取20 g苜蓿青貯樣品裝入聚乙烯袋中，并加180 mL滅菌蒸餾水，利用均質器(BagMixer-400VW;Interscience,法國)拍打90 s使袋中樣品充分混合制成青貯浸提液。采用便攜式pH計(FG-2;Mettler Toledo,上海)測定青貯浸提液pH。取袋中部分混合液用4層紗布過濾，所獲得濾液經高速低溫離心機(6 500×g,4 ℃)離心5 min，再經0.45 μm濾膜過濾，利用高效液相色譜儀(HPLC;JascoCorp,日本)分析測定乳酸、乙酸、丙酸及丁酸的含量。

1.4 總黃酮提取率

參照劉香萍等[13]的方法，采用超聲波輔助法提取苜蓿青貯樣品所含黃酮類化合物。以縱坐標為吸光度(A)，橫坐標為蘆丁質量濃度(C，mg/g)繪制標準曲線,本試驗標準曲線為Y=12.06X+0.011(R2=0.999 9)。取2 mL提取液測定510 nm處吸光度，按照標準曲線計算苜蓿總黃酮提取率：

總黃酮提取率(mg/g)=(C×N×V)/m。

式中：C為曲線質量濃度(mg/mL)；N為提取液稀釋倍數；V為最初提取液定容體積(mL)；m為樣品質量(g)。

1.5 β-葡萄糖苷酶活性

參考Funamoto等[14]和Kaewsuksaeng等[15]的方法制得酶粗提液，使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)對酶粗提液進行β-葡萄糖苷酶活性的測定。

1.6 槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量

根據黃寧[16]的方法分析槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量。本試驗采用高效液相色譜儀對苜蓿青貯中3種黃酮苷元含量進行定量分析。試驗參照黨亞鋒等[17]方法，色譜條件：c18硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫25 ℃；流動相，乙腈：0.25%磷酸水溶液(50∶50)；檢測波長360 nm；進樣量10 μL;單次分析時間10 min。

1.7 數據統計分析

試驗數據經Excel 2010整理，根據雙因素完全隨機設計模型，使用SAS 9.0的GLM程序分析數據：

Yijl=μ+αi+βj+(α×β)ij+eijl。

式中：Yijl代表青貯發酵品質；μ為總體平均值；αi為添加處理i(i=1，2)的效應；βj為發酵時間處理j(j=0，1，3，5，7，15，22，39，46，53，60，67，74)的效應；(α×β)ij為添加處理與發酵時間處理的互作效應；eijl為試驗誤差。采用Tukey法鑒定比較均值差異顯著性(P<0.05)。

采用SPSS Statistics 21軟件對有機酸含量、總黃酮提取率進行相關性分析，P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平；采用中線性回歸分析程序逐步回歸分析，在P<0.05水平下，建立回歸方程。

2 結 果

2.1 添加乳酸菌對苜蓿青貯常規化學成分的影響

由表2可知，隨著發酵時間延長，粗脂肪含量呈現逐漸增加的趨勢，干物質、有機物、粗蛋白質、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量均呈現逐漸降低的趨勢。添加乳酸菌組干物質含量在發酵第0、1、3、15、22、39、60、74天顯著高于對照組(P<0.05)，有機物含量在第3、5、39、46、74天顯著高于對照組(P<0.05)，粗蛋白質含量在第22、46、53、60、67、74天顯著高于對照組(P<0.05)，粗脂肪含量在第1、3、5、7、15、22、46、53天顯著高于對照組(P<0.05)，添加及時間處理在各指標上均表現出顯著的交互作用(P<0.05)。

表2 添加乳酸菌對苜蓿青貯常規化學成分的影響(干物質基礎)

續表2項目 Items干物質DM有機物OM粗蛋白質CP粗脂肪EE酸性洗滌纖維ADF中性洗滌纖維NDF無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第15天Day 1542.84±0.25b88.93±0.1625.94±0.066.43±0.00b27.13±0.7941.78±2.0445.23±0.28a89.29±0.1925.94±0.066.55±0.01a26.59±1.0140.89±1.34無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第22天Day 2241.01±0.44b88.99±0.1426.20a±0.036.76±0.01b27.25±0.9744.19±0.53a45.73±0.32a89.29±0.1426.00b±0.386.91±0.10a26.66±1.4040.11±0.93b無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第39天Day 3940.72±2.04b88.99±0.04b26.07±0.056.82±0.0326.99±1.5540.09±0.7645.21±0.90a89.30±0.09a26.45±0.087.19±0.0226.32±1.2740.25±1.52無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第46天Day 4642.16±1.3388.87±0.04b25.37±0.06b6.79±0.01b26.45±0.6138.72±1.8043.98±0.5189.18±0.09a25.58±0.01a6.99±0.02a26.20±1.9638.78±1.15無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第53天Day 5341.86±1.3188.82±0.2626.32±0.05b7.14±0.01b26.33±2.4040.07±1.6144.03±1.0489.17±0.3226.50±0.03a7.30±0.01a25.98±1.2539.84±0.83無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第60天Day 6041.10±1.39b88.84±0.1125.85±0.06b7.10±0.3326.20±2.9739.30±3.9445.38±0.33a89.01±0.1026.03±0.05a7.17±0.1225.60±0.7339.19±2.63無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第67天Day 6741.89±2.4588.82±0.2125.03±0.02a6.92±1.0826.07±3.0937.94±2.5744.85±0.3688.98±0.2924.83±0.08b7.13±0.2525.30±2.2537.14±1.47無添加(對照) No addition (Control)添加乳酸菌 Addition LAB第74天Day 7440.73±0.98b88.85±0.04b24.69±0.03b6.98±0.1325.70±2.4237.28±2.4844.89±0.38a88.90±0.05a24.85±0.03a7.30±0.1625.06±1.7437.12±2.14SEM0.778 0.3110.0910.1521.1351.361時間 Time<0.0050.0070.1060.0050.2170.267添加 Addition0.016 <0.005 <0.005 <0.005 0.001<0.005添加×時間 Addition×time<0.005<0.005<0.005<0.0050.002<0.005

2.2 添加乳酸菌對青貯發酵品質的影響

由表3可知，苜蓿青貯pH隨著苜蓿青貯發酵時間延長顯著降低(P<0.05)，乳酸、乙酸含量及氨態氮/總氮均顯著上升(P<0.05)；添加乳酸菌組pH在第15、39、60、74天顯著低于對照組(P<0.05)，除第0、3、5天外，其他發酵天數乳酸含量顯著高于對照組(P<0.05)；除第0、3、74天外，其他發酵天數乙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)；第3、5、7、15、22、39、53天丙酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，第3、7、15、46、53、60天氨態氮/總氮顯著低于對照組(P<0.05)；所有樣品中均未檢出丙酸和丁酸。添加及時間處理在各指標上均表現出顯著交互作用(P<0.05)。

2.3 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性、3種黃酮苷元含量的影響

由表4可知，隨著發酵時間的延長，總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性呈先升高后降低的趨勢，槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量均顯著上升(P<0.05)；在整個發酵過程中，添加乳酸菌組的總黃酮提取率顯著高于對照組(P<0.05)，β-葡萄糖苷酶活性在第3、5、53天顯著高于對照組(P<0.05)，槲皮素含量在整個發酵過程均顯著高于對照組(P<0.05)，山奈酚含量除第1、15、22、46、67天外，其他天數均顯著高于對照組(P<0.05)，異鼠李素含量除第0、1、5、15天外，其他天數均顯著高于對照組(P<0.05)；添加及時間處理在各指標上均表現出顯著交互作用(P<0.05)。

表3 添加乳酸菌對苜蓿青貯發酵品質的影響

2.4 總黃酮提取率與發酵產物的關系

由表5可知，總黃酮提取率與pH存在極顯著負相關性(P<0.01)，與乳酸含量存在極顯著正相關性(P<0.01)，與乙酸含量存在顯著正相關性(P<0.05)。

2.5 總黃酮提取率、主要苷元的回歸分析

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(X2)為自變量，以總黃酮提取率(mg/g)為因變量(Y)，建立回歸方程：Y=4.958+0.692X1+0.022X2，其中，樣本量n=3，相關系數R=0.733，添加和時間處理均對總黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(X2)為自變量，以槲皮素含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=15.925X1+0.244X2-7.365，其中，樣本量n=3，相關系數R=0.840，添加和時間處理均對槲皮素含量有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB組=1)和天數(X2)為自變量，以異鼠李素含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=1.669X1+0.174X2+1.564，其中，樣本量n=3，相關系數R=0.982，添加和時間處理均對異鼠李素含量有極顯著影響(P<0.01)。

選用處理(X1，對照組=0，LAB處理組=1)，天數(X2)為自變量，以山奈酚含量(μg/mL)為因變量(Y)，建立回歸方程為：Y=55.338X1+3.489X2+157.752，其中，樣本量n=3，相關系數R=0.842，添加和時間處理均對異鼠李素含量有極顯著影響(P<0.01)。

表4 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性、主要苷元含量的影響

表5 總黃酮提取率與pH及有機酸含量的相關性分析

3 討 論

3.1 添加乳酸菌對青貯發酵品質的影響

氨態氮含量反映了青貯飼料蛋白質降解程度，被廣泛應用于衡量青貯飼料發酵品質的好壞，其比值越大，說明被分解的氨基酸和蛋白質越多，青貯效果越差[18]。本研究中，添加乳酸菌組青貯的pH、氨態氮/總氮顯著降低，乳酸、乙酸、丙酸含量顯著增加；隨著發酵時間延長，pH逐漸顯著降低，氨態氮/總氮及乳酸、乙酸、丙酸含量均逐漸顯著增加。王木川等[19]通過比較多種添加劑對苜蓿青貯品質，發現植物乳桿菌添加降低了苜蓿青貯的pH、氨態氮/總氮，提高了乳酸、乙酸含量，同時添加乳酸菌組未檢出丁酸。王麗學等[20]比較植物乳桿菌、片球菌和芽孢桿菌對苜蓿青貯發酵品質及營養成分的影響，發現植物乳桿菌能顯著降低pH，顯著提高乳酸含量。

3.2 添加乳酸菌對苜蓿青貯總黃酮提取率的影響

類黃酮是苜蓿含有的主要活性生物成分之一，其含量受光照、溫度、土壤及空氣條件、生物因素的影響，苜蓿青貯中黃酮含量受發酵過程及添加劑的影響[21]。本研究中，乳酸菌的添加顯著提高了苜蓿青貯總黃酮提取率，隨著發酵時間的延長總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。pH與總黃酮提取率存在極顯著負相關性，隨著乳酸菌的添加和發酵天數的延長pH下降，總黃酮提取率也逐漸上升；乳酸、乙酸的逐漸產生也會造成pH的下降，所以乳酸、乙酸含量對總黃酮提取率存在顯著正相關性。王洋等[7]分別以植物乳桿菌、干酪乳桿菌及戊糖片球菌為添加劑制作苜蓿青貯，分別在30、60 d測定總黃酮提取率，結果表明3種乳酸菌的添加均能顯著提高苜蓿總黃酮提取率，其中植物乳桿菌添加效果最明顯，同時各添加組60 d黃酮提取率均高于或等于30 d。姜義寶等[22]在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌，分別在3、5、7、15、30、60 d測定總黃酮提取率，研究發現隨著苜蓿青貯發酵時間延長總黃酮提取率逐漸增加，除3 d外其余發酵天數植物乳桿菌添加組黃酮提取率均高于對照組。

3.3 添加乳酸菌對苜蓿青貯β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶是重要的纖維素水解酶，能水解類黃酮糖苷鍵將化合態黃酮糖苷轉化為可被動物吸收利用的游離態黃酮苷元，常應用于類黃酮的生物轉化。本研究中，乳酸菌的添加能顯著提高β-葡萄糖苷酶活性，同時隨著發酵時間的延長，β-葡萄糖苷酶活性呈現先升高后降低的趨勢。曾子毅等[23]研究發現，5株植物乳桿菌均具有產β-葡萄糖苷酶特性，其酶活性為4.630～14.168 U/g。Donkor等[24]研究發現，嗜酸乳桿菌、乳酸雙歧桿菌及干酪乳桿菌發酵大豆均能產生β-葡萄糖苷酶。因此，β-葡萄糖苷酶的活性在一定程度上與乳桿菌數量成正比，這與本試驗結果一致。

3.4 添加乳酸菌對苜蓿青貯3種黃酮苷元含量的影響

黃酮類化合物的主要活性形式苷元僅占總黃酮含量的3%左右，因此將黃酮由結合態糖苷轉化為游離態苷元的技術手段尤為重要[25]。本研究中，添加乳酸菌顯著提高了槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種黃酮苷元含量。隨著發酵時間的延長，槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量呈逐漸上升趨勢。賴婷等[26]分別以7種不同乳酸菌為添加劑對桂圓肉進行發酵，并檢測發酵前后結合態與游離態黃酮含量比值，發現7種乳酸菌均能不同程度增加結合態與游離態黃酮含量比值，其中植物乳桿菌轉換能力最強。Wei等[27]采用5株不同乳酸菌對豆乳進行發酵并檢測發酵前后游離態黃酮苷元含量，發現結合態至游離態轉化率高達62%～96%。李俶等[28]利用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌對南酸棗進行發酵，發現發酵后南酸棗中游離黃酮含量提高1.1倍。

4 結 論

綜上所述，添加乳酸菌可以顯著提高苜蓿青貯的發酵品質，發酵品質良好的苜蓿青貯可以提高總黃酮提取率、β-葡萄糖苷酶活性以及槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量。