飼喂初乳對新生羔羊腸道滲透性及黏附微生物組成的影響

楊 超 田全華 陽 利 程 艷 賀志雄* 譚支良

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術研究中心，農業部中南動物營養與飼料科學觀測實驗站，動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙410125；2.中國科學院大學，北京100049；3.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，武漢430205；4.湖南農業大學動物科學技術學院，長沙410128)

新生反芻動物在最初24～36 h內，其腸上皮為具有從初乳中吸收大分子物質能力的胎兒型腸上皮，營養物質主要通過滲透作用被胎兒吸收，對新生胎兒后期的生長發育有重要的影響[1-3]。有研究報道，新生反芻動物在出生48 h后，其腸道逐漸趨于“關閉狀態”，腸上皮逐漸由具備吸收大分子營養物質能力的胎兒型腸上皮更新為不能通透大分子物質的成年型腸上皮[4]。

初乳除了含有豐富的脂肪、蛋白質、乳糖和礦物質等營養物質外，還含有免疫球蛋白、維生素、激素、生長因子、細胞因子和酶等生物活性物質，具有促進動物生長發育、完善其免疫功能的作用[5]。新生動物及時攝入足量的初乳會盡快建立自身被動免疫，從而降低腸道和呼吸系統疾病[6-7]。腸道微生物按其黏附位置的不同可分為食糜黏附微生物和組織黏附微生物，其中組織黏附微生物數量遠低于食糜黏附微生物，但其對幼齡動物的影響比食糜黏附微生物更為重要[8]。據報道，初乳可調控新生反芻動物腸道發育和腸道微生物的定植過程，例如，新生犢牛在出生后12 h內飼喂初乳顯著提高了其小腸黏膜中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的相對豐度，并阻止了大腸桿菌(Escherichiacoli)的定植[9]。對新生動物而言，小腸段主要負責營養物質的吸收，其中初乳中大分子營養物質主要通過空腸段吸收[10]。因此，本試驗擬選擇新生羔羊空腸為研究對象，探究飼喂初乳對其腸道滲透性及其黏附微生物組成的影響，以期為新生羔羊初乳飼喂策略的完善及健康養殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養管理

本試驗選取初生重[(1.99±0.08) kg]相近、健康狀況良好、未采食母體初乳的新生贛西黑山羊16只，隨機分為2組(每組8只)，分別飼喂代乳料(代乳料組)和初乳(初乳組)。代乳粉購自北京精準動物營養研究中心，其營養成分含量見表1。代乳料按照代乳粉和溫水1∶5的比例進行配制，攪拌混勻至充分溶解后，室溫晾至40 ℃并用奶瓶進行飼喂。由于山羊初乳收集難度較大，加之山羊初乳由于羊關節炎-腦炎(caprine arthritis-encephalitis，CAE)病毒的污染，被新生山羊攝入后會導致其高發病率和致死率[11-12]。為減少疾病發生率，生產中通常使用牛初乳來飼喂新生山羊作為免疫球蛋白的供體，從而抵御CAE初乳的感染[13]。本試驗所用初乳收集自湖南省優卓牧業牧場的5頭奶牛(分娩后24 h內)，所有初乳充分混勻后進行飼喂，初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量為15.43 mg/mL，具體營養成分含量見表1。

羔羊在出生后迅速與母羊分離，用碘伏在臍帶處消毒，并使用干毛巾擦拭完身上黏液，稱量其初生重并做記錄。新生羔羊分組后單欄飼養，使用保溫燈進行保暖，并在出生后2 h內喂完代乳料或初乳。飼喂前對奶瓶進行清洗和消毒，晾干后使用。飼喂前后用濕毛巾將羔羊口部周圍擦拭干凈。代乳料組羔羊出生后2 h內飼喂5%體重的代乳料，初乳組羔羊在出生后2 h內飼喂5%體重的牛初乳，初乳飼喂量參照Moretti等[10]的報道。為測定羔羊腸道滲透性，分別從2組新生羔羊中隨機選取6只，在代乳料和初乳中分別添加0.5 g甘露醇和1.0 g乳果糖進行飼喂，甘露醇和乳果糖飼喂量及血液采集時間點參照Minuti等[14]的報道。所有羔羊在出生后12 h屠宰取樣。

表1 代乳粉和初乳營養成分含量

1.2 樣品采集

用于腸道滲透性檢測的羔羊分別在喂完初乳或代乳料0、2、4、6、8、10 h時頸靜脈采血，使用5 mL抗凝采血管收集血液，在室溫下以3 000×g離心15 min分離血漿，置于-20 ℃保存用于后續腸道滲透性指標測定。所有羔羊經頸靜脈放血致死后，迅速分離出空腸前段組織(距十二指腸5 cm處)，截取1 cm×3 cm的組織塊，用生理鹽水沖洗干凈內容物后置于-80 ℃保存，用于DNA提取。

1.3 腸道滲透性測定

將各時間點血漿樣品在4 ℃融解后12 000 r/min離心10 min，吸取上清至新的1.5 mL離心管，隨后取400 μL并加入25 μL內標蜜二水一糖溶液(80 μg/mL)，再加入800 μL乙腈渦旋混勻，靜置10 min以沉淀蛋白質；之后12 000 r/min離心10 min，小心吸取全部上清，并向沉淀中加入400 μL水，渦旋混勻后靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清并將2次上清合并，使用離心濃縮儀(Christ RVC2-18 CD plus)濃縮離心至干。吸取300 μL衍生試劑(體積比為4∶1的吡啶-甲醇溶液，含有32 mg/mL鹽酸羥胺和45 mg/mL 4-二甲氨基吡啶)加入衍生瓶，加蓋密封后在75 ℃條件下加熱30 min，其間振蕩數次；冷卻至室溫后加入1 mL乙酸酐，密封后在75 ℃條件下再次加熱20 min，待冷卻至室溫后加入1.5 mL二氯甲烷，充分振蕩。最后清除過量的衍生試劑：1)加入1 mL 1 mol/L HCl，緩慢振蕩30 s后移除水相，之后加入1 mL蒸餾水重復洗滌2次，在最后1次清洗過程中盡可能去除水相；2)剩余的有機相在40 ℃下離心濃縮揮干后，用200 μL的乙酸乙酯-正己烷混合溶劑(體積比為1∶1)溶解后，5 000 r/min離心5 min，轉移全部上清至配有內插管的色譜進樣瓶中，進行色譜-質譜分析。標準曲線配制方法、色譜條件及質譜圖譜的數據讀取等參照許麗衛等[15]的方法。

1.4 空腸黏附微生物多樣性

空腸組織DNA提取使用動物組織DNA提取試劑盒(DP304，天根生化科技有限公司)進行，提取完成后在NanoDrop 2000上進行純度和濃度測定，并使用瓊脂糖凝膠(2%)電泳進行DNA完整性檢測。采用細菌通用引物338F(引物序列為：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(引物序列為：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S DNA“V3+V4”高度可變區進行PCR擴增。對上述PCR擴增產物進行純化、定量和均一化后進行文庫構建，質檢合格的文庫基于Illumina HiSeq 2500平臺進行高通量測序。基于FLASH(v1.2.11)軟件對測序得到的PE reads按照overlap長度進行拼接得到原始Tags，之后使用Trimmomatic(v0.33)和UCHIME(v4.2)軟件對數據進行質控和過濾，區分樣本后在相似度97%的水平上對序列進行操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學分析。基于OTU對數據進行多樣性分析，并基于分類學信息在門和屬分類水平上對微生物組成進行統計分析。

1.5 數據統計與分析

血漿中甘露醇和乳果糖濃度變化相關指標的計算方法參照Fischer等[16]的報道，其中曲線下方正增量面積采用梯形法則進行計算，最大濃度變化量為最大濃度與初始濃度的差值。腸道形態學、滲透性指標以及微生物相對豐度等數據經Excel 2019進行初步整理后，采用SPSS 25.0軟件的獨立樣本t檢驗進行統計學分析。試驗結果以平均值和均值標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 腸道滲透性

代乳料組和初乳組新生羔羊血漿中甘露醇濃度隨時間的變化趨勢如圖1所示，在各時間點2組新生羔羊血漿中甘露醇濃度無顯著差異(P>0.05)。由表2可知，代乳料組新生羔羊血漿中甘露醇達到最大濃度的平均時間為3.67 h，最大濃度為2.80 μg/mL，最大濃度變化量為2.26 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.76；初乳組新生羔羊血漿中甘露醇達到最大濃度的平均時間為3.33 h，最大濃度為3.16 μg/mL，最大濃度變化量為2.69 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.95。2組新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化相關指標[達到最大濃度的平均時間、最大濃度、最大濃度與時間的比值、2 h曲線下方正增量面積、6 h曲線下方正增量面積、10 h曲線下方正增量面積及最大濃度變化量]均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化

代乳料組和初乳組新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化趨勢如圖2所示，在各時間點2組新生羔羊血漿中乳果糖濃度無顯著差異(P>0.05)。由表3可知，代乳料組新生羔羊血漿中乳果糖達到最大濃度的平均時間為4.00 h，最大濃度為2.75 μg/mL，最大濃度變化量為2.27 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.69；初乳組新生羔羊血漿中乳果糖達到最大濃度的平均時間為5.00 h，最大濃度為2.02 μg/mL，最大濃度變化量為1.57 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.40。2組新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化相關指標[達到最大濃度的平均時間、最大濃度、最大濃度與時間的比值、2 h曲線下方正增量面積、6 h曲線下方正增量面積、10h曲線下方正增量面積及最大濃度變化量]均無顯著差異(P>0.05)。

表2 新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化指標

圖2 新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化

2.2 飼喂初乳對新生羔羊空腸黏附微生物組成的影響

2.2.1 α多樣性分析

如表4所示，代乳料組與初乳組測序分別得到97%相似度的OTU 343.25和435.75個，差異不顯著(P>0.05)，測序樣本覆蓋度2組間差異也不顯著(P>0.05)。基于OTU聚類結果進行α多樣性分析，其中代乳料組ACE指數和Chao1指數低于初乳組，但2組間無顯著差異(P>0.05)；初乳組Shannon指數顯著高于代乳料組(P<0.05)，而Simpson指數顯著低于代乳料組(P<0.05)，表明飼喂初乳顯著增加新生羔羊空腸黏附微生物多樣性。

2.2.2 β多樣性分析

β多樣性分析結果可清晰顯示不同組間樣本微生物群落結構的差異。主坐標分析(PCoA)和非度量多維尺度(NMDS)分析2點間距離表示樣本間微生物群落的相似程度，樣本間距離越近，表明2個樣本微生物組成相似性越高。如圖3所示，2組樣本未明顯區分開，表明在OTU水平上代乳料組和初乳組新生羔羊的空腸黏附微生物群落組成相似性較高。

2.2.3 門水平上微生物組成

由表5可知，在門水平上變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為兩大優勢菌門，二者之和在代乳料組和初乳組分別占總菌的81.43%和64.52%。初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門的相對豐度顯著低于代乳料組(P<0.05)，而厚壁菌門和Epsilonbacteraeota的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。

表3 新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化指標

表4 飼喂初乳對新生羔羊空腸黏附微生物α多樣性的影響

圖3 新生羔羊空腸黏附微生物主坐標分析和非度量多維尺度分析

表5 空腸黏附微生物在門水平上的相對豐度

2.2.4 屬水平上微生物組成

由表6可知，飼喂初乳可顯著降低新生羔羊空腸黏附微生物中埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對豐度(P<0.05)，而初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中有益菌如乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。此外，初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中百伯史坦菌屬(Bibersteinia)、毛螺旋菌科UGG-008(Lachnospiraceae_UCG-008)、螺桿菌屬(Helicobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和未分類瘤胃球菌科相關菌屬(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。

表6 空腸黏附微生物在屬水平上的相對豐度

3 討 論

新生反芻動物由于特殊的胎盤結構使其母體內的抗體不能轉運至胎兒側，出生后無被動免疫能力，容易受到外來病原菌的侵襲，從而威脅其生命。新生反芻動物只能通過及時從初乳中攝取免疫球蛋白來建立自身的被動免疫，以此抵御各類病原菌的侵襲[17]。據報道，在現代集約化生產中，約有50%的死亡新生犢牛是由腹瀉引起的，56%的疾病由胃腸道狀態紊亂引發[18-19]。因此，完善新生反芻動物飼養管理和初乳飼喂策略可極大提高其成活率。

初乳是新生反芻動物激素和生物活性因子的重要來源，與胃腸道的成熟和發育息息相關，其中除含有免疫球蛋白和營養物質外，還含有激素和促生長因子如胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[5,20-21]。研究發現，分娩后第1天內奶牛初乳和山羊初乳中總固形物、蛋白質、脂肪、乳糖、灰分等營養成分含量無顯著差異[22]。奶牛和山羊分娩后第1次收集的初乳中IgG含量分別為59.8和41.9 mg/mL，免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量均較低且無顯著差異[23-24]。由于奶牛初乳易采集、泌乳量較山羊多、營養價值較山羊初乳高等特點，其在生產中替代山羊初乳具有可行性。

腸道滲透性是指腸道黏膜上皮被某些相對分子質量大于150的物質分子以非載體或通道介導的被動擴散方式通過的特性，是檢測腸道完整性的重要指標[25]。腸道滲透性主要受應激、致病菌和炎癥等的影響，當機體發生應激、腸道受到致病菌侵襲或局部產生炎癥時，其滲透性增加，破壞腸上皮的完整性，從而影響其屏障作用的發揮[26]。然而，新生羔羊在出生后的24～48 h內腸上皮類型為胎兒型，其主要特點是通透性大，可使大分子物質以被動擴散方式進入腸上皮而被吸收進入血液[4]。隨發育時間的延長，羔羊腸道逐漸“閉合”，腸上皮逐漸轉化為成年型腸上皮，對大分子物質的通透性降低，其屏障作用增強。本試驗首次探究了山羊腸道滲透性的測定和分析方法以及初乳對其滲透性的調控作用，結果顯示飼喂初乳并不能在短時間(12 h)內改變腸道滲透性，其通透性大小可能很大程度上與發育時間相關。

腸道微生物在宿主免疫系統發育、營養物質利用和整體生理方面起著至關重要的作用[27]。新生動物腸道微生物群落的建立與黏膜免疫系統和次級淋巴結構的發育有關，其中某些特定的細菌屬能夠為腸上皮細胞產生能量底物，出生后按時飼喂初乳可通過促進腸道微生物的定植，對新生動物的健康起重要作用[28]。本試驗中，初乳組Shannon指數顯著高于代乳料組，而Simpson指數顯著低于代乳料組，Shannon指數越高且Simpson指數越低表明微生物群落多樣性越高。α多樣性分析結果表明，在出生后飼喂初乳可顯著提高新生羔羊腸道微生物群落的豐富度，并可增加腸道微生物群落的多樣性。在門水平上，新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門占比最高，其次為厚壁菌門和擬桿菌門，與Rey等[29]在犢牛上的研究結果一致。初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中厚壁菌門的相對豐度顯著高于代乳料組，表明其腸道微生物對碳水化合物和蛋白質的消化吸收能力更強[30]。變形菌門中包含多種病原菌，代乳料組新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門的相對豐度顯著高于初乳組，表明飼喂初乳可抑制有害菌的定植。在屬水平上，初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中未分類瘤胃球菌科相關菌屬、毛螺旋菌科UCG-008和脫硫弧菌屬的相對豐度顯著高于代乳料組，而瘤胃球菌通常被認為是機體內的有益菌[31]。毛螺旋菌科細菌通常參與動物體內糖代謝，尤其是多糖降解過程[32]。據Jiao等[33]報道，脫硫弧菌屬的相對豐度與瘤胃氨態氮和揮發性脂肪酸含量呈正相關，表明其可能參與動物體內氨態氮和揮發性脂肪酸代謝過程。雙歧桿菌屬作為一種益生菌被廣泛應用，可調節宿主免疫應答和免疫細胞表型，還可通過產生乙酸鹽來保護宿主免受腸道致病菌的感染[34]。乳桿菌屬可與腸道屏障發生相互作用，進而起到維護腸道免疫系統的作用[35]。Fischer等[16]研究發現，出生后盡快飼喂初乳可顯著增加犢牛結腸黏膜中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度，而大腸桿菌的相對豐度顯著降低，與本試驗結果相似，表明出生后盡快飼喂初乳可促進有益菌定植，抑制有害菌定植，從而維持腸道健康。

4 結 論

新生羔羊出生后飼喂初乳對其腸道滲透性無影響，但可促進新生羔羊腸道乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的定植，降低大腸桿菌等有害菌的定植，對維持腸道健康具有積極作用。