酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊生長性能、血清生化指標、瘤胃細菌多樣性及KEGG通路的影響

姜碧薇 周玉香 王 甜 李 斐

(1.寧夏大學農學院，銀川750021；2.寧夏職業技術學院，銀川750021)

苜蓿干草粗蛋白質含量高，適口性好，是反芻動物優質的粗飼料來源和重要的飼草作物[1]。但我國優質苜蓿干草缺乏，若以苜蓿干草作為單一粗飼料，不能滿足養殖業的需要。我國是農業大國，秸稈產量每年約為9.0億t[2]，但利用率較低且大規模的焚燒造成了環境污染。如何有效利用秸稈，降解其纖維素含量并與苜蓿干草配合使用，使其成為反芻動物的優質粗飼料，一直是動物營養研究的熱點。通過飼用酶制劑的添加降解植物細胞壁的纖維素和半纖維素已是生物技術在動物營養和飼料工業中應用最成功的例子[3]，在粗飼料的發酵中已運用純熟。益生菌發酵粗飼料能夠提高其營養價值，促進動物生長，提高生產性能[4-8]。稻草和苜蓿干草均為肉羊養殖中的常見粗飼料，目前，通過酶菌混合處理稻草和苜蓿干草尚未見報道。鑒于此，本試驗采用纖維素酶與復合益生菌(主要成分為乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌等)混合處理寧夏地區常見的2種粗飼料稻草和苜蓿干草，參考課題組成員王萌[9]的試驗結果，將飼糧精粗比設為30∶70，并將稻草與苜蓿干草以60∶40組合作為粗飼料，研究酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊對其生長性能、血清生化指標、瘤胃細菌多樣性及KEGG通路的影響，以期為粗飼料資源的開發及其在灘羊生產實踐中的科學應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草的制備

準備適量的稻草和苜蓿干草，用粉碎機粉碎至3～5 cm備用。參照文獻[10]確定纖維素酶與復合益生菌的添加量，按照配制比例準確稱取纖維素酶[活性≥10000U/g；添加量為0.1%]、復合益生菌[主要成分為酵母菌(活菌數≥1.0×108CFU/g)、乳酸菌(活菌數≥1.0×107CFU/g)和枯草芽孢桿菌(活菌數≥5.0×107CFU/g)，添加量為2 kg/t]和麥麩(按照待處理粗飼料的1%稱取)后，加入適量的水，充分攪拌，混合均勻后采取噴淋的方式，邊噴灑邊攪拌，使水溶液與待處理粗飼料充分混合并將含水量調至70%左右，最后利用青貯裹包機直接進行打捆包膜后，密封保存30 d。稻草和苜蓿干草處理前后分別測定其營養物質含量，其中干物質含量參照《飼料水分的測定方法》(GB/T 6435—2006)測定，粗蛋白質(CP)含量參照《飼料中粗蛋白測定方法》(GB/T 6435—2006)測定，中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[11]的方法進行測定，粗灰分含量參照《飼料中粗灰分的測定方法》(GB/T 6435—2006)測定，鈣(Ca)含量采用高錳酸鉀法測定，磷(P)含量采用鉬黃比色法(UV-1780紫外分光光度計，島津，日本)測定。處理前后稻草和苜蓿干草營養成分含量見表1。

表1 處理前后稻草和苜蓿干草營養成分含量(干物質基礎)

1.2 試驗動物與試驗設計

飼養試驗于2019年7—9月在寧夏農墾寧羊農牧有限公司有機牧場進行。選擇體重[(31.03±1.00) kg]相近、健康狀況良好的3月齡斷奶寧夏灘羊(公羊)20只，隨機分為2組(對照組和試驗組)，每組10只。對照組飼喂以未經處理的稻草和苜蓿干草為粗飼料的試驗飼糧，試驗組飼喂以酶菌混合處理的稻草和苜蓿干草為粗飼料的試驗飼糧。

1.3 試驗飼糧與飼養管理

試驗飼糧參照農業行業標準《肉羊飼養標準》(NY/T 816—2004)和生產實踐配制，其組成及營養水平見表2。試驗飼糧精粗比為30∶70，粗飼料由稻草與苜蓿干草按照60∶40的比例進行配制，對照組飼糧中稻草與苜蓿干草未經處理，試驗組飼糧中稻草與苜蓿干草經酶菌混合處理。參試羊在試驗前進行驅蟲等常規防疫，定期對圈舍進行消毒與清掃。預試期15 d，正試期60 d，每日早晚(06:30和18:00)分2次等量飼喂，自由飲水。

表2 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

續表2項目 Items對照組 Control group試驗組 Trial group玉米 Corn1515豆粕 Soybean meal1010麥麩 Wheat bran11胡麻餅 Jute cake22食鹽 NaCl11預混料 Premix1)11合計 Total100100營養水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)8.768.98粗蛋白質 CP10.0811.63鈣 Ca0.560.79磷 P0.170.17

1.4 樣品收集與指標測定

1.4.1 生長性能測定

從正試期開始，每日準確記錄羊只的給料量與剩料量，計算干物質采食量。分別在試驗開始當天和試驗結束當天早晨空腹稱取2組參試羊的體重，分別作為初始體重和終末體重，計算每只羊的總增重、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.4.2 血液樣品采集與血清生化指標測定

血液樣品采集：分別于正試期的第1天、第30天和第60天晨飼前對2組參試羊進行靜脈采血，采集的血樣在離心管內放置40 min，之后用離心機于3 800 r/min離心10 min，離心結束后吸取血清(每個樣品取1 mL血清2份)，置于-20 ℃保存。試驗結束后，使用邁瑞BS-180全自動生化分析儀，利用試劑盒(購于深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)測定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(URE)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLB)含量，計算白蛋白/球蛋白(A/G)。

1.4.3 瘤胃液的采集與DNA提取及建庫測序

飼養試驗結束當天清晨空腹采集瘤胃液，每組選擇3只參試羊，采用負壓采集器，經導管通過口腔食道，深入到瘤胃中部采集瘤胃液約100 mL，每個瘤胃液樣品經4層薄紗布過濾后液氮保存。將瘤胃液樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行V3+V4區擴增并進行Illumina HiSeq平臺測序。通過原始控制程序過濾原始Tags，以97%以上匹配度為標準，將有效的Tags分配到操作分類單元(OTU)。采用MetaProdigal (V2.6.3)預測宏基因組蛋白質編碼基因，CH-HIT (V4.6.5)構建非冗余集合預測基因模型。采用序列同源性搜索工具DIAMOND (V0.8.24)以及BLASTX (V2.2.31+)完成蛋白質功能的序列注釋。

1.5 數據統計與分析

生長性能、血清生化指標及瘤胃細菌多樣性等數據用Excel 2007記錄并作簡單處理后，采用SAS 8.2軟件進行方差分析，并采用LSD法進行多重比較，以P<0.05和P<0.01分別作為差異顯著和極顯著的判斷標準。宏基因組數據Unigenes通過DIAMOND軟件(閾值E值≤1e-5)比對到KEGG數據庫，集合基因豐度表格計算不同數據庫比對結果的豐度信息，以進行系統豐富的組間功能差異分析和比較。

2 結果與分析

2.1 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊生長性能和經濟效益的影響

2.1.1 對灘羊生長性能的影響

由表3可知，試驗組與對照組的初始體重無顯著差異(P>0.05)，而試驗組的終末體重較對照組有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；試驗組的干物質采食量比對照組降低了1.63%，但差異不顯著(P>0.05)；試驗組的總增重、平均日增重極顯著高于對照組(P<0.01)，料重比極顯著低于對照組(P<0.01)，其中試驗組總增重比對照組提高了44.36%，平均日增重比對照組提高了44.37%，料重比比對照組降低了31.89%。上述結果表明，用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，可以提高灘羊的增重，降低料重比。

2.1.2 對灘羊經濟效益的影響

由表4可知，試驗組與對照組灘羊每日飼料成本差異不大，但試驗組1只羊的日平均純利潤為3.39元，比對照組提高了1.33元。該結果表明，用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，能夠提高灘羊養殖的經濟效益。

表3 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊生長性能的影響

表4 經濟效益分析

2.2 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊血清生化指標的影響

由表5可知，第1天時，試驗組與對照組相比，各項血清生化指標均無顯著差異(P>0.05)。第30天時，試驗組血清尿素含量顯著低于對照組(P<0.05)，其他各項指標無顯著差異(P>0.05)。第60天時，試驗組血清總蛋白、球蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，血清尿素含量極顯著低于對照組(P<0.01)。該結果表明，用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，可以顯著提高灘羊血清總蛋白、球蛋白含量，極顯著降低灘羊血清尿素含量。

表5 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊血清生化指標的影響

2.3 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊瘤胃細菌多樣性的影響

2.3.1 對灘羊瘤胃細菌OTU數量的影響

經測定，對照組共獲得reads 113 515 252個，試驗組共獲得reads 126 324 584個。由表6可知，對照組與試驗組的覆蓋度均大于0.98，說明測序量和測序深度合理，能夠準確反映灘羊瘤胃內的細菌組成情況；試驗組的OTU數量極顯著高于對照組(P<0.01)，說明用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，提高了其瘤胃細菌的OTU數量。

表6 各組瘤胃細菌OTU數量

2.3.2 對灘羊瘤胃細菌Alpha多樣性的影響

由表7可知，試驗組Chao指數、ACE指數和Simpson指數與對照組差異不顯著(P>0.05)，Shannon指數極顯著高于對照組(P<0.01)。上述結果說明用酶菌混合處理后的稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，提高了其瘤胃細菌的Shannon指數。

表7 16S rDNA檢測Alpha多樣性

2.3.3 對灘羊瘤胃細菌Beta多樣性的影響

圖1為基于瘤胃細菌OTU的主坐標分析(PCoA)。由圖1可知，主坐標成分1(PCo1)和主坐標成分2(PCo2)對樣本間變異的貢獻度分別為33.43%和20.04%，能夠充分解釋樣本間的變異；且PCoA顯示，同組內樣本距離較近，說明同組內物種多樣性差異較小，對照組與試驗組之間樣本距離較遠，說明對照組與試驗組之間細菌多樣性存在差異。該結果表明，用酶菌混合處理后的稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，影響了其瘤胃細菌的多樣性。

藍色圓點為對照組的3個平行樣本，橙色圓點為試驗組的3個平行樣本。圖2同。

2.3.4 對灘羊瘤胃細菌優勢菌門及門水平差異物種的影響

由表8可知，對照組與試驗組的優勢菌門均為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，三者總量占總菌門的90%以上。其中，試驗組變形菌門的豐度極顯著低于對照組(P<0.01)，擬桿菌門的豐度極顯著高于對照組(P<0.01)，厚壁菌門的豐度較對照組提高了4.58%，但差異不顯著(P>0.05)。由圖2可知，試驗組與對照組存在顯著差異的菌門分別為變形菌門、Patescibacteria、擬桿菌門、Kiritimatiellaeota、浮霉菌門、藍藻門、螺旋體門和互養菌門，其中試驗組變形菌門、Patescibacteria的比例顯著高于對照組(P<0.05)，擬桿菌門、Kiritimatiellaeota、浮霉菌門、藍藻門、螺旋體門、互養菌門的比例顯著低于對照組(P<0.05)。上述結果說明用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，其瘤胃內的差異菌門多達8個，影響了其瘤胃內環境。

2.4 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊瘤胃細菌KEGG通路的影響

本試驗中，對照組共獲得基因5 121 024個，試驗組共獲得基因6 461 155個。與KEGG數據庫對比可得各樣品KEGG注釋圖(圖3)。由圖3可知，在A層級中，富集到新陳代謝(metabolism)層級的基因數量最多，其次是遺傳信息處理(genetic information processing)、環境信息處理(environmental information processing)、細胞過程(cellular processing)以及人類疾病(human disease)層級。該結果表明，以酶菌混合處理稻草和苜蓿干草作為粗飼料飼喂灘羊，其瘤胃內主要功能酶是參與新陳代謝、遺傳信息處理和環境信息處理。在B層級中，豐度排名前25的通路見表9。由表9可知，試驗組嘌呤代謝(purine metabolism)、雙組分系統(two-component system)和ABC轉運蛋白(ABC transporters)等22條通路的基因數量與對照組無顯著差異(P>0.05)，而嘧啶代謝(pyrimidine metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)這3條通路的基因數量極顯著高于對照組(P<0.01)。

表8 全樣本優勢菌門豐度

Proteobacteria：變形菌門；Bacteriodetes：擬桿菌門；Planctomycetes：浮霉菌門；Cyanobactria：藍藻門；Spirochaetes：螺旋體門；Synergistetes：互養菌門。

3 討 論

3.1 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊生長性能和經濟效益的影響

反映反芻動物生長性能的主要指標有采食量、日增重、料重比等。有研究表明，適宜的苜蓿補飼可以提高稻草纖維物質的消化率[12]。本試驗選用稻草與苜蓿干草以60∶40比例組合作為粗飼料，增重效果較為理想。研究表明，在畜禽養殖過程中添加一些維生素制劑、微量元素制劑、酶制劑、微生物制劑等可以提高畜禽的生長性能和肉品質[13]。邱玉朗等[14]研究發現，用混合微生物發酵秸稈飼喂肉羊，其平均日增重提高36%，料重比降低28.68%。王平等[15]研究表明，在育肥綿羊基礎飼糧中添加纖維素酶后，日增重可提高43.98%。李軍[16]的研究結果顯示，益生菌劑的添加可以提高肉羊的生長性能。申春紅[17]的研究結果顯示，在基礎飼糧中添加2.0%復合微生物制劑可以提高肉牛的生長性能。本試驗運用纖維素酶和復合益生菌混合處理稻草和苜蓿干草。以其作為粗飼料飼喂灘羊，顯著提高了灘羊的總增重和平均日增重，并降低了料重比，說明該處理方式提高了灘羊的生長性能。

Metabolism：新陳代謝；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Metabolism of cofactors and vitamins：輔助因子和維生素代謝；Energy metabolism：能量代謝；Lipid metabolism：脂質代謝；Glycan biosynthesis and metabolism：聚糖生物合成代謝；Metabolism of other amino acids：其他氨基酸代謝；Biosynthesis of other secondary metabolites：其他次生代謝產物的生物合成；metabolism of terpenoids and polyketides：萜類化合物和聚酮的代謝；Xenobiotics biodegradation and metabolism：外源生物的生物降解與代謝；Genetic Information Processing：遺傳信息處理；Replication and repair：復制和修復；Translation：翻譯；Folding, sorting and degradation：折疊、排序和退化；Transcription：謄寫；Environmental Information Processing：環境信息處理；Membrane transport：膜運輸；Signal transduction：信號轉導；Cellular Processes：細胞過程；Cellular community-prokaryotes：原核微生物的細胞通訊；Human Diseases：人類疾病；Drug resistance：抗藥性。

表9 KEGG通路較高豐度基因數量(B層級)

續表9通路 Pathways對照組 Control group試驗組 Trial group錯配修復 Mismatch repair7 450.39±116.147 389.15±126.02半乳糖代謝 Galactose metabolism7 019.39±166.407 140.79±85.82DNA復制 DNA replication6 983.21±81.216 727.74±116.81半胱氨酸和蛋氨酸代謝 Cysteine and methionine metabolism6 900.86±188.466 872.82±112.98肽聚糖類生物合成 Peptidoglycan biosynthesis6 553.50±219.817 031.20±120.82丙酮酸代謝 Pyruvate metabolism5 992.15±238.946 218.89±180.47甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝 Glycine, serine and threonine metabolism5 784.30±82.586 081.66±69.13果糖和甘露糖代謝 Fructose and mannose metabolism5 405.37±21.145 447.33±90.28氧化磷酸化作用 Qxidative phosphorylation5 262.32±44.575 368.43±37.51苯丙氨酸、絡氨酸和色氨酸的生物合成 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis5 127.29±160.875 318.04±43.51磷酸戊糖途徑 Pentose phosphate pathway5 020.90±125.125 176.13±69.83二羧酸代謝 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism4 705.13±64.82B4 854.40±43.49A甲烷代謝 Methane metabolism4 299.57±102.034 587.22±117.95

有研究表明，飼糧中添加酶制劑能夠顯著提高養殖戶的經濟效益。藺國文[18]在枯黃玉米秸稈中添加不同比例的復合酶制劑飼喂肉牛，結果表明，0.10%的酶制劑效果最佳，日增重達到1.192 kg，比對照組提高了23.49%，經濟效益顯著增加。本試驗用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，1只羊的日平均純利潤提高了1.3元，說明該處理方式的經濟效益較為理想。

3.2 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊血清生化指標的影響

血清生化指標反映了機體新陳代謝的變化情況[19]。其中，血清總蛋白不但承載了運輸營養物質、調節運輸物質等重要生理功能，還與組織蛋白質合成有密切聯系，其含量能夠反映機體的營養狀況和蛋白質消化率[20]。血清球蛋白又稱為免疫球蛋白，能夠反映機體的抗病能力。良好的營養狀況可使血清總蛋白和球蛋白含量維持在一個較高水平，二者含量的升高表明機體代謝活動增強[21]。血清尿素是機體蛋白質分解代謝的重要產物之一，體現了蛋白質的代謝情況。機體血清尿素含量降低，說明機體對氮的利用效率升高[22]。康懷艷[23]研究了益生菌發酵飼料對奶山羊血清生化指標和產奶性能的影響，結果表明，益生菌發酵飼料能夠提高奶山羊血清總蛋白和球蛋白含量，降低血清尿素氮含量。余淼等[24]用芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌發酵飼料飼喂肉牛，結果顯示，肉牛的血清總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A和免疫球蛋白M含量顯著提高。這與本試驗結果一致。本試驗結果表明，用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，可以提高灘羊血清總蛋白、球蛋白含量，降低血清尿素含量，有益于灘羊的健康養殖。

3.3 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊瘤胃細菌多樣性的影響

目前隨著宏基因組學的興起，學者們針對瘤胃生態環境的研究越來越趨向于微觀的分子。在瘤胃微生態系統當中，微生物區系的結構十分復雜，瘤胃微生物種群的數量以及區系組成受多種因素的影響。近年來，有關飼用纖維素酶或益生菌作為飼料添加劑對反芻動物瘤胃消化代謝影響的研究較多。有研究表明，在飼糧中添加分解纖維素酶制劑可以顯著提高奶牛瘤胃微生物數量[25]。黃慶生等[26]研究表明，酵母培養物能夠顯著提高瘤胃總細菌數量，而對其他指標沒有顯著影響。Kong等[27]研究了飼喂不同粗飼料對奶牛瘤胃細菌多樣性及結構的影響，結果顯示，在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門占整個瘤胃細菌的比例較大，這與本試驗研究結果一致。

3.4 酶菌混合處理稻草和苜蓿干草對灘羊瘤胃KEGG通路的影響

KEGG能夠從分子水平上系統研究差異基因的功能，因此是代謝通路研究的核心[28]。它涵蓋了基因組、疾病和信號通路等數據庫，整合了相關蛋白質、基因、代謝等多種信息，通過比對已知通路，按照不同功能分級。褚毅[29]通過在豬的基礎飼糧中添加脂肪和糖研究代謝通路的差異，結果發現功能基因進行KEGG富集時集中在代謝通路上，進一步研究注釋在代謝通路上的差異功能基因，發現添加脂肪和糖造成的差異主要表現在脂肪酸代謝方面。多項研究表明，二羧酸代謝與脂肪酸代謝有關。有研究表明，尿嘧啶參與了某些B族維生素的合成，其含量變化可能會引起B族維生素的變化[30]。本試驗中，試驗組嘧啶代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、二羧酸代謝3條通路的基因數量極顯著高于對照組，說明用酶菌混合處理稻草和苜蓿干草飼喂灘羊，提高了灘羊嘧啶代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、二羧酸代謝的基因數量，有可能會增強B族維生素的合成和脂肪酸的代謝功能。

4 結 論

酶菌混合處理稻草和苜蓿干草可以提高灘羊的增重和養殖的經濟效益，同時，該處理方式提高了灘羊血清總蛋白、血清球蛋白含量，降低了血清尿素含量，改變了灘羊瘤胃細菌多樣性和部分功能基因的數量。在本試驗條件下，用酶菌混合處理的稻草和苜蓿干草飼喂灘羊的效果較優，有益于灘羊的健康養殖，可在生產中推廣使用。