銀杏-杜仲葉復合發酵物對肉雞抗氧化能力和胸肌肉品質的影響

曹銀娣 張旭暉 孫智遠 汪貴斌 曹福亮*

(1.南京林業大學林學院，南方現代林業協同創新中心，南京210037；2.青島農業大學科技處，青島266109；3.江蘇農林職業技術學院畜牧獸醫學院，句容212400)

由于畜禽類飼糧全面禁抗政策的實施，化學合成抗氧化劑對人類健康亦有潛在威脅，人們將視角轉向可飼用天然產物飼料添加劑的開發[1]。目前，將銀杏-杜仲葉復合發酵物(GEL)作為飼料添加劑，研究其對肉雞生長性能和抗氧化等方面的研究報道在國內外都比較少[2]。在畜牧生產中，微生物發酵是一種從植物產品中去除抗營養因子的有效手段，同時是能夠產生具有生物活性物質的有效途徑，可以促進動物的生長和健康。大量研究發現，功能性植物資源作為飼料添加劑能夠增強動物機體的抗氧化能力[3-4]，改善肉品風味，顯著提高肉品質。近年來大量研究表明，以植物資源如杜仲、銀杏、辣木、黃芪等為原料生產功能性添加劑，添加到動物飼糧中，可以有效改善動物的生產性能，減少氧化損傷[5-8]，并提高肉品質[9-11]。本課題組前期研究發現，發酵銀杏葉可以提高肉雞的抗氧化能力，改善肌肉系水力和肉品質[12-14]。

發酵過程中，微生物將銀杏-杜仲葉復合原料中不易消化吸收的大分子物質轉化變成小分子，容易被腸黏膜吸收，加速血液中的有效成分達到有效濃度，從而提高動物的生產性能和肉品質。本試驗選用愛拔益加(AA)肉雞作為研究對象，研究飼糧中添加不同水平的GEL對肉雞抗氧化功能和肉品質的影響，并設未發酵物[未發酵銀杏-杜仲葉(NGEL)]組作為對照，為銀杏-杜仲葉生物飼料添加劑用于肉雞生產提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 GEL的制備

1)10月份于南京林業大學銀杏園采摘的銀杏葉，自然晾曬，備用；12月份于河南理工大學杜仲園收集的杜仲落葉，自然晾曬，備用；

2)分別將銀杏葉和杜仲葉60 ℃烘干，磨粉過40目篩，裝入自封袋密封保存；

3)接種2.0%黑曲霉菌和1.0%產朊假絲酵母混合發酵銀杏葉和杜仲葉配比為2∶1的復合物，添加麩皮20%(g/g總干料)，含3.0%(NH4)2SO4、2.0%葡萄糖、2.0% KH2PO4、0.5% MgSO4·7H2O，物料初始pH為5，濕度為60%，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為96 h。

通過黑曲霉和產阮假絲酵母生物轉化后的GEL，營養豐富，總黃酮和綠原酸含量達到最優，分別由發酵前的1.67%和0.42%提高至2.13%和0.50%，提高幅度為27.55%和19.48%。代謝能為13.15 MJ/kg，粗蛋白質含量為25.23%。

1.2 試驗動物

選取1日齡健康AA肉仔雞360只(由山東煙臺蘇佳麗禽業有限公司提供)，平均體重為(49.24±3.89) g，差異不顯著(P>0.05)。

1.3 試驗設計與飼糧

選取360只1日齡的健康AA肉雞，隨機分成6組，即對照組、NGEL組[在基礎飼糧中添加NGEL，前期(1～21日齡)添加0.3%，后期(22～24日齡)添加0.6%]及4個GEL組(GEL1、GEL2、GEL3、GEL4組，即在基礎飼糧中添加GEL，前期GEL分別添加0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，后期分別添加0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)，每組6個重復，每個重復10只雞。試驗期42 d。采用玉米-豆粕型基礎飼糧，其組成及營養水平見表1。試驗采用重量替代法，用麩皮在不同的飼糧中補齊試驗添加物的量。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.4 樣品的采集與制備

分別于21、42日齡08:00開始進行采樣。前1天19：00開始斷糧，保持飲水供應。每組中每個重復取1只雞，每組共6只，先進行稱重，后采用5 mL離心管進行頸靜脈采血，并于低溫3 500 r/min離心15 min制備血清，置-20 ℃冰箱保存，待測。在每只雞的大體一致的相應部位采集胸肌樣品，去除脂肪和結締組織，每只雞各取4塊，分別用于測定24和48 h的滴水損失(10 g)、45 min和24 h的pH(50 g)、肉色(15 g)、烹飪損失和嫩度(剪切力)(30 g)。

1.5 抗氧化指標的測定

1.5.1 血清中α-生育酚(α-TOH)含量的測定

采用Kayden等[15]的方法測定血清α-TOH的含量。取100 μL血清樣品與2.0%連苯三酚充分混勻，置70 ℃的恒溫振蕩水浴中2 min；加入3.6 mmol/L KOH 0.25 mL，再置70 ℃恒溫振蕩水浴中30 min。冰水浴冷卻后，加入正己烷2 mL和蒸餾水0.5 mL，2 min劇烈振蕩，將1 mL最上層的正己烷α-TOH抽提液轉移至4 mL玻璃試管中，制備1、2、4、6、8和10 μg/mL的α-TOH標準品，分別加2.0%菲羅啉200 μL到樣品管和標準品管中，充分混勻，再加1 mmol/L FeCl3200 μL，1 min渦旋混勻，再加H3PO4200 μL，渦旋混勻，在534 nm處比色法讀取吸光值。由標準曲線計算各樣品中的α-TOH含量。

1.5.2 血清和組織中抗氧化與脂質過氧化指標的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清、肝臟和胸肌中丙二醛(MDA)含量；按Noguchi等[16]的方法測定血清和肝臟中還原型谷胱甘肽(GSH)含量及胸肌中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；根據鐵離子(Fe3+)還原法測定胸肌總抗氧化能力(T-AOC)；使用黃嘌呤氧化法測定胸肌總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.6 胸腿肌肉品質的測定

1.6.1 pH的測定

分別于45 min和24 h時，用嫩度儀取樣器在備存肉樣上鉆1個小孔，將用便攜式數顯pH計的電極直接插入小孔中，使電極頭完全被包埋在肉樣中，讀取pH(pH45 min和pH24 h)。每測1個樣品后，均用蒸餾水充分沖洗電極，并注意校正。

1.6.2 系水力的測定

烹飪損失：每個樣取胸肌約10 g(M)，用錫箔紙包住，置75 ℃水中煮15 min，稱重(m)。

烹飪損失(%)=[(M-m)/M]×100。

滴水損失：分別取胸肌約10 g，稱重(W1)，置于充氣的塑料袋中，封口，避免肌肉塊貼壁，吊掛于4 ℃冰箱內，24 h后取出胸肌，拭去肌肉表面水分，稱重(W2)。

24 h滴水損失(%)=[(W1-W2)/W1]×100。

稱量后的肉樣重新放入充氣的塑料袋中，封口，掛回4 ℃冰箱，經24 h再取出肉樣，擦干肉樣表層水分，稱重(W3)。

48 h滴水損失(%)=[(W1-W3)/W1]×100。

1.6.3 胸肌剪切力(嫩度)的測定

將沿左側胸肌取的樣品，去除肉樣表面附著的脂肪及多余的結締組織，于塑料袋中密封，在溫度15～16 ℃下進行尸僵前處理24 h。4 ℃下再熟化24 h。取出熟化充分的肉樣，室溫放置1 h，解除塑料袋包裝，將溫度計插入肌肉中心部，然后包扎好，袋口朝上，置于80 ℃水浴鍋中，進行加熱，當肌肉中心溫度達到70 ℃時，取出肉樣，冷卻至室溫。將每塊肌肉沿肌纖維方向修成1 cm×1 cm×3 cm的長條，3～5塊，測定剪切力3次(Salter剪切力儀，G2R Elec. Mf g. Co.)，取平均值。

1.6.4 肉色評定

分別取出肉樣，沿肌纖維方向，切取2 cm×2 cm的胸肌樣品，用色差儀(CHROMA METER CR-400, KONZCAminOLTA SENSING, INC,日本)測定亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值。

1.6.5 胸肌脂肪酸含量的測定

分別稱取0.2 g經過凍干處理的樣品，放入試管中；加內標1 mL，加NaHCO3/甲醇溶液4 mL，混勻，50 ℃放20 min后，加鹽酸/甲醇溶液2 mL，80 ℃下孵育1 h；充分振蕩；冷至室溫，先后加入水2 mL和正己烷6 mL，充分振蕩，離心分層；取200 μL上層溶液，加600 μL正己烷，用氣相色譜儀進行分析。

GC-14C氣相色譜儀：附帶N-2000雙通道色譜工作站軟件(浙江大學智能信息工程有限公司)；色譜柱：長30 m，內徑0.22 mm，柱溫195 ℃；載氣：氫氣流速22.5 mL/min，空氣流速80 mL/min，氮氣流速9 mL/min；進樣器溫度：250 ℃；進樣量：0.5～1.0 μL；分流比60∶1。

總脂肪酸含量(mg/g)=(峰總體積-內標體積)/
內標體積×(內標重量，mg/g
樣品的干重)[17]。

1.7 統計分析

數據經Excel 2010整理后，采用SPSS 22.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，最后采用SPSS 22.0軟件做線性回歸分析，差異顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 GEL對肉雞血清α-TOH含量的影響

由圖1可知，GEL1、GEL2、GEL3和GEL4組血清α-TOH含量分別比對照組提高了9.43%、20.54%、35.02%和57.24%，這4組分別比NGEL組提高了7.62%、18.54%、32.78%和54.64%；且GEL3和GEL4組均顯著高于對照組和NGEL組(P<0.05)；線性回歸分析結果表明，隨著飼糧GEL添加水平的提高，血清α-TOH含量呈顯著線性增加(P<0.05)。

2.2 GEL對肉雞血清和肝臟GSH含量的影響

由圖2可知，與對照組相比，4個GEL組的血清GSH含量分別顯著提高了14.10%、23.50%、25.21%和24.35%(P<0.05)，而各GEL組間均無顯著差異(P>0.05)；GEL2、GEL3和GEL4組的肝臟GSH含量最高，分別比對照組和NGEL組提高了33.24%、32.97%、32.42%和24.68%、24.42%、23.92%(P<0.05)。

數據柱標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 飼糧添加GEL對肉雞血清和肝臟GSH含量的影響

2.3 GEL對肉雞血清和肝臟MDA含量的影響

由圖3所示，飼糧添加GEL對血清和肝臟MDA含量的影響趨勢是一致的。與對照組和NGEL組相比，GEL2、GEL3、GEL4組的血清或肝臟的MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

2.4 GEL對肉雞胸肌抗氧化與脂質過氧化指標的影響

由表2可知，隨著飼糧中GEL添加水平的增加，胸肌中T-SOD的活性和T-AOC呈線性增加，而MDA含量呈線性降低；GEL2、GEL3和GEL4組胸肌中T-SOD活性顯著高于對照組和NGEL組(P<0.05)，而各組間的胸肌GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)；就胸肌中T-AOC而言，GEL2、GEL3和GEL4組顯著高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，不同的飼糧處理均對胸肌MDA含量產生顯著影響(P<0.05)，GEL3組的胸肌MDA含量顯著低于NGEL組和GEL1組(P<0.05)。

2.5 GEL對肉雞胸肌肉品質的影響

由表3可知，飼糧中添加GEL對胸肌的pH24 h、24和48 h的滴水損失、48 h的烹飪損失和剪切力均產生顯著影響(P<0.05)。同時，隨飼糧GEL添加水平的增加，24 h滴水損失、48 h滴水損失和剪切力呈顯著線性降低(P=0.021和P=0.039、P=0.016)；同時，GEL2、GEL3和GEL4組的剪切力、24 h滴水損失和48 h滴水損失顯著低于對照組(P<0.05)。GEL2和GEL3組的烹飪損失顯著低于對照組(P<0.05)。

圖3 飼糧添加GEL對肉雞血清和肝臟MDA含量的影響

表2 飼糧添加GEL對肉雞胸肌抗氧化和脂質過氧化指標的影響

表3 飼糧添加GEL對肉雞胸肌肉品質的影響

2.6 GEL對肉雞胸肌脂肪酸組成的影響

如表4可見，飼糧處理對C16∶0(P=0.033)、C18∶0(P=0.001)、C18∶2(P=0.001)、C18∶3(P=0.001)、C20∶4(P=0.001)和總多不飽和脂肪酸(PUFA)(P=0.001)含量產生了顯著影響。與對照組或NGEL組相比，GEL2、GEL3和GEL4組的胸肌C16∶0和C18∶0含量顯著降低(P<0.05)，就總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量而言，4個GEL組均比對照組和NGEL組有顯著升高(P<0.05)，同時，GEL3、GEL4組與GEL1組間的總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量均有顯著差異(P<0.05)；隨著飼糧中GEL添加水平的增加，C16∶0(P=0.033)、C18∶0(P=0.001)和總飽和脂肪酸(P=0.041)含量呈顯著線性降低(P<0.05)，而總PUFA、C18∶2、C18∶3和C20∶4含量呈顯著線性增加(P<0.05)。

表4 飼糧添加GEL對肉雞胸肌脂肪酸組成的影響

3 討 論

3.1 GEL對肉雞生長性能和抗氧化功能的影響

發酵是飼糧生產中常用的一種處理工藝，通過微生物可產生具有促進健康作用的生物活性物質。經過微生物發酵處理的植物資源，含有豐富的酶、維生素和生長因子[18]，銀杏黃酮甙元在發酵后更容易被動物腸道消化吸收[19]。本試驗已發表數據揭示了飼糧中添加GEL能夠顯著提高肉雞飼料效率，且有效改善腸道結構，提高消化酶的活性，進而增強腸道消化吸收功能，從而提高了肉雞的生長性能[20]。

抗氧化酶防御主要包括SOD、CAT和GSH-Px，它們在預防脂質過氧化的有害影響方面起著重要作用[21]。MDA含量用于評估脂質過氧化程度[22-23]。SOD是動物機體抗氧化損傷系統中的重要成員之一，在生物體內它是一種以自由基為底物的酶，可以平衡氧化和抗氧化過程，通過SOD活性能夠間接反映機體清除自由基的能力。T-AOC能夠反映機體清除自由基的能力。就氧化還原而言，本試驗結果顯示，肉雞飼糧中添加不同水平的GEL能提高胸肌T-SOD活性和T-AOC，降低血清、肝臟及胸肌MDA的含量，這和GEL中的總黃酮、綠原酸對細胞自由基和抗氧化平衡的調控相關。黃酮類化合物是具有多種酚類結構的一類天然物質，酚類物質具有很高的抗氧化活性，能夠通過穩定細胞內產生的自由基，起到抗氧化的作用[24-25]。

多不飽和脂肪酸的提高通常增加脂質過氧化的水平。GSH參與細胞防御體系，是天然活性氧(ROS)在細胞內的清除劑，可以保護組織不受氧化損傷，能夠有效防止脂肪酸過氧化[26-27]。作為一種免疫調節分子，脂肪酸能夠介導細胞通訊、膜流動性、第二信使傳遞[28]。血清α-TOH和GSH含量隨著GEL添加水平的提高有顯著提高，原因可能是在發酵過程中產生的微生物酶類，作用于植物細胞壁，使具有抗氧化功能的酚類物質釋放出來[29-30]。酚酐被β-葡萄糖苷酶分解成苷元，苷元具有親油性，有利于通過細胞膜磷脂雙層膜，所以很容易被上皮細胞吸收[29,31]。

3.2 GEL對肉雞肉品質的影響

眾所周知，肌肉pH能夠影響多種肉質特性，如肉色、嫩度、系水力(滴水損失和蒸煮損失)及其他肌肉性狀，是最重要的宰后因素之一。此外，屠宰后肉的pH迅速下降能夠導致蛋白質變性，進而導致肉色蒼白和系水力降低[24]。在本試驗中，屠宰后胸肌肉pH24 h隨著飼糧GEL添加水平的增加呈線性增加。該結果提示飼糧GEL能夠將肉的pH維持在相對較低的范圍內。肉的系水力是直接與肌內脂肪和水分含量相關的。較低的系水力說明通過滲出損失的營養成分較多，最終導致肉較干較硬。降低的pH能夠影響系水力。嫩度(剪切力)可能是決定消費者對肉的可接受性的最重要的食用品質指標[32]。本試驗數據表明，系水力和剪切力的變化趨勢與pH是吻合的。杜仲葉中的綠原酸可以使細胞膜的脂質層避免過氧化自由基的干擾，進而減少細胞膜上的載體通道，減緩脂質的過氧化，抑制亞鐵離子(Fe2+)誘導MDA的形成[33]，阻止肌肉過快氧化，降低肌肉滲水性和肌肉反光，維持胴體性狀及肉品質的相對穩定。飼糧中添加杜仲提取物能不同程度地降低肉產品的滴水損失，改善肉色和嫩度，增添肉的多汁性和風味；此外，杜仲葉中含有蘇氨酸和蛋氨酸，它們能夠加快脂肪代謝、改善肉質性狀[33]。

本試驗結果發現，飼糧中添加GEL能夠有效改變脂肪酸的組成，表現在增加或保護不飽和脂肪酸(UFA)的氧化，或降低胸肌總飽和脂肪酸(SFA)的含量。SFA含量的降低是由于C16∶0和C18∶0含量顯著降低所致，這可能與飼糧GEL的添加對血清膽固醇(TC)含量的降低作用有關[12]。由于胸肌中C18∶2、C18∶3和C20∶4含量的增加，胸肌中總PUFA含量顯著增加。這可能是由于過氧化物酶能夠降低總UFA氧化，它的活性增強，總PUFA含量就增加了。臨床數據顯示，冠狀心臟疾病(CHD)與飼糧TC和SFA的攝取呈顯著相關[26]。本試驗中，肉雞飼糧添加GEL后42 d，與對照組相比，其胸肌總SFA含量較低，且本試驗中，脂肪酸組成的結果與增強的T-AOC和增加的SOD活性的結果相互支持。

4 結 論

飼糧中添加GEL(前期添加0.2%～0.5%，后期添加0.4%～1.0%)可提高42日齡肉雞血清的抗氧化能力，降低脂質過氧化水平，改善胸肌品質和脂肪酸組成。