純種柯樂豬與巴×柯雜交豬腸道菌群結構的研究

楊 蓮 燕志宏* 黃維江 楊仕鈺 吳光松顧麗菊 林鵬飛 楊 蓉 李 平 任麗群 張 蕓

(1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽550000；2.貴州大學貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽550000；3.貴州大學動物科學學院，貴陽550000；4.開陽縣畜禽品種改良站，貴陽550000；5.貴州優農谷生態產業有限公司，畢節551700；6.貴州省物資現代物流集團有限責任公司，貴陽550000；7.貴州省畜禽種質測定中心，貴陽550000；8.貴州省農業區域經濟發展中心，貴陽550000)

柯樂豬是我國優良地方豬種之一，屬于烏金豬系列的一個品種，被列入《中國畜禽遺傳資源志·豬志》，毛色有黑、鼠灰、“六白”、粽色4種，主產于貴州省畢節市赫章縣，具有抗病力強、適應性強、耐粗飼、肉質鮮美、口感糯而細膩等特點，是“宣威火腿”的原材料，目前以高端豬肉原料進行市場開發[1-2]。但柯樂豬是脂肪型豬，存在瘦肉率低等問題，相關研究表明，柯樂豬達到最佳屠宰期(體重100 kg左右)時，瘦肉率僅為(43.48±4.45)%[3-4]，阻礙了市場的開發。巴克夏豬是英國古老的培育豬種之一，中國華南豬對巴克夏豬有過種源貢獻，巴克夏豬以黑毛為主、具有“一黑六白”特點，嘴筒、四肢、尾尖毛色為白色，其余部分是黑色[5]，巴克夏豬生長速度快、瘦肉率高[6]。為了提高柯樂豬的瘦肉率，保持以黑毛為主的特點，采用巴克夏豬為父本、柯樂豬為母本進行雜交生產F1代豬(以下簡稱巴×柯雜交豬)。

相關研究表明，不同品種的豬腸道菌群結構是具有差異的[7]，不同豬品種進行雜交能發揮最大的雜交優勢，提高生長性能、肉質、繁殖力等[8]。但不同品種的豬進行雜交后，其腸道菌群結構是否具有差異的研究相關報道較少。因此，本試驗研究純種柯樂豬與巴×柯雜交豬腸道菌群結構特性及差異性，旨在揭示柯樂豬耐粗飼特性及巴×柯雜交豬對粗纖維的消化能力，為后期微生物添加劑的設計及巴×柯雜交豬標準化養殖打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.2 樣品采集

8月齡時純種柯樂豬和巴×柯雜交豬各隨機選體重(體重達100 kg左右)相近的3頭健康豬(3頭純種柯樂豬體重分別為108、106、105 kg；3頭巴×柯雜交豬體重分別為106、105、102 kg)進行屠宰，共屠宰6頭，屠宰后每頭豬采取十二指腸、空腸、回腸、結腸4個腸段內容物于滅菌的10 mL離心管中，放于-78.5 ℃干冰中保存，送至微基生物科技(上海)有限公司(http://www.tinygene.com)進行MiSeq文庫制備(QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒進行基因組DNA抽提，PCR擴增，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收,FTC-3000TMreal-time PCR儀進行實時熒光定量PCR)，而后進行Illumina MiSeq 2×300 bp高通量測序與生物信息學分析[操作分類單元(OTU)聚類分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析等]。

1.3 統計分析

對試驗所得數據用Excel 2016進行初步處理后，Alpha多樣性相關數據采用SAS 9.2軟件進行顯著性分析，高通量測序數據采用Metastats (http://metastats.cbcb.umd.edu/)在不同分類學水平上進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 OTU信息統計與聚類分析

所有樣品的優化序列為862 381條，純種柯樂豬有422 847條優化序列，巴×柯雜交豬有439 534條優化序列；根據97%相似性水平，對所有序列進行OTU聚類分析，韋恩圖(圖1)顯示，整個腸道，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬共有OTU為773個，純種柯樂豬特有OTU為17個，巴×柯雜交豬特有OTU為91個；十二指腸段，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬共有OTU為132個，純種柯樂豬特有OTU為54個，巴×柯雜交豬特有OTU為150個；空腸段，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬共有OTU為104個，純種柯樂豬特有OTU為60個，巴×柯雜交豬特有OTU為73個；回腸段，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬共有OTU為132個，純種柯樂豬特有OTU為31個，巴×柯雜交豬特有OTU為113個；OTU最多的腸段是結腸，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬共有OTU為633個，純種柯樂豬特有OTU為18個，巴×柯雜交豬特有OTU為49個。由稀釋曲線(圖2)可知，隨著序列數增加，曲線趨向于平坦，其覆蓋指數均為0.999～1.000，說明測序數據量合理，可以進行數據分析。

2.2 Alpha多樣性分析

如表1所示，從Chao指數和ACE指數看，純種柯樂豬與巴×柯雜交豬之間差異不顯著(P>0.05)，說明這2個品種豬之間腸道微生物群落豐富度基本一致；從Shannon指數和Simpson指數看，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬之間差異不顯著(P>0.05)，說明這2個品種豬之間腸道微生物群落多樣性基本一致；隨著腸道自上而下，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬腸道微生物群落豐富度及多樣性逐漸增加。

BK：巴×柯雜交豬；KK：純種柯樂豬；T：全腸道；D：十二指腸；J：空腸；L：回腸；C：結腸。下圖同。BK: Berkshire×Kele hybrid pigs; KK: pure-bred Kele pigs; T: total intestine; D: duodenum; J: jejunum; L: ileum; C: colon. The same as below.

圖2 稀釋曲線

2.3 Beta多樣性分析

通過主成分分析(PCA，圖3)和主坐標分析(PCoA，圖4)比較純種柯樂豬與巴×柯雜交豬腸道菌群結構相似性，可以發現，2個品種豬的大部分樣品交叉聚集到一起，這說明純種柯樂豬與巴×柯雜交豬腸道微生物存在一定的相似性，腸道菌群結構組成基本相似。

2.4 菌群結構分析

2.4.1 十二指腸菌群結構分析

由圖5可知，巴×柯雜交豬十二指腸中的主要菌門為無壁菌門(Tenericutes)(34.11%)、厚壁菌門(Firmicutes)(26.78%)、變形菌門(Proteobacteria)(28.16%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(5.02%)；純種柯樂豬十二指腸中的主要菌門為厚壁菌門(49.04%)、無壁菌門(40.53%)、變形菌門(9.32%)。由表2可知，巴×柯雜交豬十二指腸中擬桿菌門的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)。由圖6可知，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬十二指腸中的主要菌屬為支原體屬(Mycoplasma)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、曲桿菌屬(Curvibacter)。由表3可知，巴×柯雜交豬十二指腸中克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的相對豐度極顯著高于純種柯樂豬(P<0.01)，擬桿菌屬(Bacteroides)的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)，Mogibacterium、假丁酸弧菌屬(Pseudoscardovia)的相對豐度顯著低于純種柯樂豬(P<0.05)。

2.4.2 空腸菌群結構分析

由圖5可知，巴×柯雜交豬空腸中的主要菌門為厚壁菌門(89.40%)、變形菌門(9.81%)、放線菌門(Actinobacteria)(0.48%)；純種柯樂豬空腸中的主要菌門為厚壁菌門(98.21%)、放線菌門(0.92%)、無壁菌門(0.84%)。由圖6可知，乳桿菌屬(>35.25%)在純種柯樂豬與巴×柯雜交豬空腸中均占有絕對優勢。由表3可知，巴×柯雜交豬空腸中擬桿菌屬、厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)。

表1 純種柯樂豬和巴×柯雜交豬腸道微生物群落Alpha多樣性分析

圖3 主成分分析

2.4.3 回腸菌群結構分析

由圖5可知，巴×柯雜交豬回腸中的主要菌門為厚壁菌門(86.12%)、變形菌門(12.92%)、放線菌門(0.79%)；純種柯樂豬回腸中的主要菌門為厚壁菌門(97.58%)、變形菌門(0.89%)、放線菌門(0.75%)、無壁菌門(0.52%)。由圖6可知，乳桿菌屬、Intestinibacter、Terrisporobacter、降解纖維素菌屬(Cellulosilyticum)為純種柯樂豬與巴×柯雜交豬回腸中的優勢菌屬。由表3可知，巴×柯雜交豬回腸中糞球菌屬(Coprococcus)的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)。

圖4 主坐標分析

2.4.4 結腸菌群結構分析

由圖5可知，厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門(Spirochaetae)為純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中的優勢菌門。由表2可知，巴×柯雜交豬結腸中藍細菌門(Cyanobacteria)的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)。由圖6可知，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中相對豐度較高的菌屬有普氏菌屬(Prevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、乳桿菌屬、密螺旋體屬(Treponema)、厭氧弧菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬、顫螺菌屬(Oscillospira)、毛螺菌屬(Lachnospira)。由表3可知，巴×柯雜交豬結腸中脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的相對豐度極顯著高于純種柯樂豬(P<0.01)，月形單胞菌屬(Selenomonas)的相對豐度顯著高于純種柯樂豬(P<0.05)，消化球菌屬(Peptococcus)、考拉桿菌屬、Flavonifractor、聚乙酸菌屬(Acetitomaculum)、Leeia的相對豐度顯著低于純種柯樂豬(P<0.05)。為了鑒定純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中富集的菌群，對純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中菌群進行LEfSe分析(圖7和圖8)，結果發現純種柯樂豬結腸中富集的菌群有厚壁菌門的聚乙酸菌屬、厚壁菌門瘤胃球菌科的不可培養瘤胃細菌4C0d_17(uncultured_rumen_bacterium_4C0d_17)、變形菌門的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、變形菌門的奈氏球菌科(Neisseriaceae)、變形菌門的Leeia、厚壁菌門考拉桿菌屬的uncultured_Veillonellaceae_bacterium、變形菌門的奈氏球菌目(Neisseriales)、厚壁菌門的Defluviitaleaceae、擬桿菌門、厚壁球菌門的消化球菌屬、擬桿菌門的擬桿菌綱和擬桿菌目、厚壁菌門的氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、厚壁菌門氨基酸球菌科的考拉桿菌屬；巴×柯雜交豬結腸中富集的菌群有變形菌門的脫硫弧菌屬、厚壁菌門的月形單胞菌屬、厚壁菌門瘤胃球菌科的柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)、變形菌門的脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)和脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、藍細菌門。

表2 純種柯樂豬和巴×柯雜交豬不同腸段菌群門水平相對豐度差異性分析

表3 純種柯樂豬和巴×柯雜交豬不同腸段菌群屬水平相對豐度差異性分析

續表3菌屬 Bacteria genus腸道 Intestine 純種柯樂豬KK巴×柯雜交豬BKP值 P-value艱難桿菌屬 Mogibacterium十二指腸 Duodenum0.019 50.002 10.036 0 Pseudoscardovia十二指腸 Duodenum0.050 30.001 10.040 5 孿生球菌屬 Gemella十二指腸 Duodenum0.016 7<0.000 10.051 4 擬桿菌屬 Bacteroides空腸 Jejunum<0.000 10.007 50.010 7 厭氧弧菌屬 Anaerovibrio空腸 Jejunum<0.000 10.007 50.019 7 瘤胃球菌屬 Ruminococcus空腸 Jejunum0.000 80.002 80.030 5 鏈球菌屬 Streptococcus空腸 Jejunum0.080 20.442 70.100 1 糞球菌屬 Coprococcus回腸 Ileum<0.000 10.004 60.039 1 考拉桿菌屬 Phascolarctobacterium回腸 Ileum<0.000 10.008 40.064 9 螺桿菌屬 Helicobacter回腸 Ileum0.335 30.000 80.087 7 脫硫弧菌屬 Desulfovibrio結腸 Colon0.017 30.208 5<0.000 1 消化球菌屬 Peptococcus結腸 Colon0.026 00.007 30.005 7 考拉桿菌屬 Phascolarctobacterium結腸 Colon4.028 12.729 00.017 0 Flavonifractor結腸 Colon0.025 80.007 40.028 0 月形單胞菌屬 Selenomonas結腸 Colon0.008 90.036 80.043 0 聚乙酸菌屬 Acetitomaculum結腸 Colon0.056 90.020 20.046 7 Leeia結腸 Colon0.621 90.169 50.049 9 毛螺菌屬 Lachnospira結腸 Colon1.187 10.683 80.051 3 Moryella結腸 Colon0.038 90.026 70.056 6 擬普雷沃菌屬 Alloprevotella結腸 Colon7.244 83.734 30.114 0 糞球菌屬 Coprococcus結腸 Colon1.896 71.253 20.123 7

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Tenericutes：無壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Unclassified：未分類；Spirochaetae：螺旋體門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍細菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Synergistetes：互養菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門。

Unclassified：未分類；Lactobacillus：乳桿菌屬；Mycoplasma：支原體屬；Escherichia：埃希菌屬；Prevotella：普氏菌屬；Megasphaera：巨球型菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Mitsuokella：光岡菌屬；Enhydrobacter：棲水菌屬；Helicobacter：螺桿菌屬；Turicibacter：蘇黎世桿菌屬；Treponema：密螺旋體屬；Cellulosilyticum：降解纖維素菌屬；Actinobacillus：放線桿菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Acinetobacter：不動桿菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Ralstonia：勞爾氏菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Pseudomonas：假單胞菌屬；Selenomonas：月形單胞菌屬；Lachnospira：毛螺菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Roseburia：羅氏菌屬；Dialister：小桿菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Olsenella：歐陸森氏菌屬；Subdoligranulum：罕見小球菌屬；Campylobacter：彎曲桿菌屬；Delftia：代爾夫特菌屬；Brevibacterium：短桿菌屬；Veillonella：韋榮氏球菌屬；Oscillibacter：顫桿菌屬；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Others：其他。

p:門 phylum；c：綱 class；o：目 order；f：科 family；g：屬 genus；s：種 species；Clostridium leptum：柔嫩梭菌；Desulfovibrionales：脫硫弧菌目；Desulfovibrionaceae：脫硫弧菌科；Cyanobacteria：藍細菌門；Deltaproteobacteria：變形菌綱；Selenomonas：月形單胞菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Neisseriaceae：奈氏球菌科；Neisseriales：奈氏球菌目；Bacteroidetes：擬桿菌門；Peptococcus：消化球菌屬；Bacteroidales：擬桿菌目；Bacteroidia：擬桿菌綱；Acidaminococcaceae：氨基酸球菌科；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬。下圖同 The same as below。

圖8 LDA判別結果圖

3 討 論

腸道菌群與豬的品種[9]、年齡[10]、飼糧組成[11-12]、飼糧纖維[13]、飼養環境[14]、抗生素[15]、微生態制劑[16-18]、酶[19]和植物提取素[20]等因素有關，也就是說影響腸道菌群的兩大主要因素是遺傳和環境。相關研究表明，環境因素對人類腸道菌群的影響遠大于宿主的遺傳背景[21]。本試驗目的是研究純種柯樂豬和巴×柯雜交豬腸道菌群結構的差異性，為了降低其他因素的影響，選擇在相同的飼養環境下飼養，從而突出遺傳差異。試驗設置重復的主要作用在于估計試驗誤差和降低試驗誤差，只有當重復在2個或2個以上的試驗上，獲得2個或2個以上試驗指標的觀測值時，才能估計試驗誤差；誤差估計值的大小與重復數的平方成反比，適當增加重復數可以降低試驗誤差，但在實際應用時，重復數太多，試驗動物將隨之大大增加，試驗動物的初始條件不易控制，也不一定能降低誤差。重復數的多少可以根據試驗的要求和試驗動物的初始條件而定，如果試驗動物初始條件差異較大，重復數應多些，若差異較小，重復數可少些。本試驗中2個品種豬的心理年齡基本一致，重復數為3頭，與相關文獻[22-25]重復數一致。

個體腸道菌群保持相對穩定，同時會隨著環境條件的改變而動態變化。隨著年齡的增長，并受飼養環境、采食方式以及食物形態等的影響，動物腸道微生物從一個簡單的、不穩定的區系逐步發展形成一個稠密的、復雜的區系[26]。仔豬出生后受到母體產道、糞便以及周圍微生物環境的影響，在胃腸道形成最初的微生物區系，之后隨著年齡的增長，最終形成一個穩定的腸道微生物區系定植在豬的胃腸道內[27]。對純種柯樂豬和巴×柯雜交豬各腸段菌群的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析顯示2個品種豬腸道菌群豐富度、多樣性和結構接近，這可能是因為純種柯樂豬和巴×柯雜交豬的母本都是柯樂豬以及二者有相同的飼養環境。

腸道菌群結構分析結果顯示，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬小腸階段厚壁菌門、變形菌門、放線菌門占絕對優勢，到了結腸階段變形菌門、放線菌門的比例降低，擬桿菌門的比例相應增加，與厚壁菌門一起構成結腸中的優勢菌門，在屬水平上乳桿菌屬為純種柯樂豬和巴×柯雜交豬小腸中的優勢菌屬，與徐娥等[22]報道一致。

短鏈脂肪酸(SCFAs)是結腸細胞的重要能量來源，由腸道微生物通過低消化率的碳水化合物發酵而產生[28-29]。在豬生產養殖中，飼糧中的植物性碳水化合物很大一部分不能被小腸消化，而是在大腸中被腸道微生物產生的分解纖維素酶降解，產生短鏈脂肪酸。本試驗中，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中的優勢菌屬有普氏菌屬、擬普雷沃菌屬、密螺旋體屬、厭氧弧菌屬、瘤胃球菌屬、糞球菌屬、顫螺菌屬、毛螺菌屬，這些菌屬是纖維降解菌，可通過消化動物體自身不能消化的植物性碳水化合物產生短鏈脂肪酸[30-34]，與文獻[24,27,36]報道一致。

宿主遺傳背景也是影響腸道菌群結構的一個主要因素[35]。不同品種豬的腸道菌群組成不同，與杜洛克母豬相比，梅山母豬和二花臉母豬的腸道總細菌、硬毛菌、擬桿菌和減少硫酸鹽細菌的數量都更高[7]。3頭不同品種豬(長白、大白、杜洛克)圈養在一起后，其腸道微生物群落變得更加相似，但仍保留一定的品種特異性，長白豬和大白豬的微生物群落與杜洛克豬的微生物群落仍有一定的差異[37]。對207頭體重105 kg的皮特蘭豬腸道菌群的研究發現，結腸菌群有著宿主遺傳性，其中部分菌屬表現出一定的遺傳力[38]。本試驗對純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中菌群在屬水平上的相對豐度進行了差異性分析，其中脫硫弧菌屬在巴×柯雜交豬結腸中的相對豐度極顯著高于純種柯樂豬，月形單胞菌屬在巴×柯雜交豬結腸中的相對豐度顯著高于柯樂豬，消化球菌屬、考拉桿菌屬、Flavonifractor、聚乙酸菌屬、Leeia在巴×柯雜交豬結腸中的相對豐度顯著低于純種柯樂豬。月形單胞菌屬、聚乙酸菌屬也屬纖維分解菌，可分解碳水化合物產短鏈脂肪酸[39-40]，消化球菌屬利用蛋白胨或氨基酸為能源產生揮發性脂肪酸，部分可發酵碳水化合物產揮發性脂肪酸[41]。相關研究表明，相對于豬的不同膳食纖維成分，在補充果膠的情況下，腸道中Leeia的比例更高[42]，說明Leeia對粗纖維有一定的降解能力。擬桿菌屬和普氏菌屬可降解動物體內不能被吸收消化的粗纖維產生琥珀酸鹽，而考拉桿菌屬利用琥珀酸鹽作為碳源產生短鏈脂肪酸為機體提供營養[43-44]。這些結腸中的大量纖維降解菌與純種柯樂豬對粗纖維的消化能力息息相關。對純種柯樂豬和巴×柯雜交豬結腸中菌群進行LEfSe分析，發現純種柯樂豬結腸中富集的菌群有厚壁菌門的聚乙酸菌屬、厚壁菌門瘤胃球菌科的uncultured_rumen_bacterium_4C0d_17、變形菌門的Leeia、厚壁菌門考拉桿菌屬的uncultured_Veillonellaceae_bacterium、擬桿菌門、厚壁球菌門的消化球菌屬、擬桿菌門的擬桿菌綱和擬桿菌目、氨基酸球菌科、考拉桿菌屬。這些細菌中，除上文提到的纖維分解菌外，瘤胃球菌科的uncultured_rumen_bacterium_4C0d_17也屬于纖維分解菌[45-46]；此外，氨基酸球菌科則是主要利用氨基酸作為能源產生乙酸和丁酸[47]。巴×柯雜交豬結腸中富集的菌群有厚壁菌門的月形單胞菌屬、產丁酸的柔嫩梭菌[48]，可以看出巴×柯雜交豬結腸中纖維降解菌的比例較弱于純種柯樂豬。

4 結 論

① 在整個菌群結構上，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬腸道中優勢菌在類別上非常接近，體現了環境相同效應，純種柯樂豬和巴×柯雜交豬的腸道菌群結構相對穩定且相似度高。

② 純種柯樂豬對粗纖維的消化能力強與腸道內含有大量的纖維降解菌(普氏菌屬、厭氧弧菌屬、瘤胃球菌屬、顫螺菌屬等)有關。

③ 引入外源血影響了腸道菌群結構，巴×柯雜交豬對粗纖維的消化能力較弱于純種柯樂豬。