急性淋巴細(xì)胞白血病患兒血清鐵調(diào)素水平及臨床意義

劉 娜，梁鈺珩，郭紅明，軒 帆，吳曉莉

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒科，河北 石家莊 050000)

急性白血病(acute leukemia，AL)是兒童時(shí)期最常見的惡性腫瘤，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)發(fā)病率最高，約占70%。隨著聯(lián)合化療方案的優(yōu)化以及造血干細(xì)胞移植、免疫治療等方法應(yīng)用，兒童ALL的無事件生存率(event-free survival，EFS)有了明顯的提高，但是治療相關(guān)的問題比如鐵超載等越來越受到關(guān)注。我們團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)急性白血病患兒血清鐵調(diào)素(Hepcidin)水平高于健康對(duì)照，但Hepcidin水平的高低對(duì)兒童ALL預(yù)后影響的研究國內(nèi)外罕見報(bào)道。Hepcidin作為鐵代謝的負(fù)性調(diào)節(jié)因素，在鐵代謝及慢性病性貧血中起重要作用，但是關(guān)于Hepcidin在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中的作用的研究相對(duì)較少。本研究通過對(duì)ALL患兒外周血中Hepcidin表達(dá)水平及其對(duì)預(yù)后的影響，以及Hepcidin與貧血、鐵代謝指標(biāo)的相關(guān)分析，探討ALL患兒血清Hepcidin水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年6月—2015年1月于我院小兒內(nèi)科確診的ALL患兒30例，診斷及治療參照兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議(第四次修訂草案)。按Hepcidin表達(dá)水平中位數(shù)進(jìn)行分組，高于中位數(shù)的定義為高水平組，低于中位數(shù)的為低水平組，每組15例。2組一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具有可比性。見表1。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前已經(jīng)接受治療的；②治療未滿一個(gè)療程；③合并引起貧血的其他疾病。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2020-R095)。設(shè)計(jì)隨訪表，以Hepcidin表達(dá)高低對(duì)患者進(jìn)行分組，收集統(tǒng)計(jì)納入組患兒的生存情況并計(jì)算無事件生存時(shí)間(event-free survival,EFS)，隨訪截止時(shí)間為2020年1月。數(shù)據(jù)包括年齡、性別、危險(xiǎn)度分級(jí)、初診時(shí)血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血清鐵蛋白(Ferritin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)。EFS為從誘導(dǎo)緩解治療開始的第1天到出現(xiàn)復(fù)發(fā)、死亡或繼發(fā)第二腫瘤的時(shí)間。

表1 30例急性淋巴細(xì)胞白血病患者基本資料Table 1 Basic information of 30 patients with ALL (n=15，例數(shù)，%)

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的收集 研究對(duì)象采清晨空腹靜脈血5 mL，將其中2 mL進(jìn)行血常規(guī)及血紅蛋白濃度檢測，另外的3 mL放促凝管中室溫凝固，凝固后低速離心3 000 r/min，20 min。取上清液1～2 mL，檢測Transferrin、Ferritin及CRP，將其余血清收集好后于-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.2試劑與方法 血常規(guī)檢測采用CELL-DYN3700血常規(guī)分析儀，Transferrin、Ferritin及CRP檢使用IMMAGE800特種蛋白免疫分析儀，EPO及Hepcidin檢測使用人鐵調(diào)素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(德國R&G公司)、EPO酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(蘇州卡爾文生物有限公司)。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad 7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，小樣本數(shù)據(jù)采用Fisher精確檢驗(yàn)校正。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。單因素及多因素生存分析采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型。雙變量正態(tài)分布資料相關(guān)分析使用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1患者生存 分析30例ALL患者按Hepcidin表達(dá)水平分成2組，高于中位表達(dá)水平的為高表達(dá)組(15例)，低于中位表達(dá)水平的為低表達(dá)組(15例)。2組Hepcidin表達(dá)量分別為(114.4±48.63)μg/L和(21.98±15.94) μg/L，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.997，P<0.05)。30例ALL患者隨訪至2020年1月，死亡及復(fù)發(fā)8例，無失訪病例，5年總體EFS為77.586%，按Hepcidin水平分組后2組生存曲線比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果見圖1。

圖1 30例ALL患者生存分析

2.2ALL患者生存影響因素分析 年齡是影響預(yù)后的因素，其中高年齡是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素(OR=4.458，P=0.036)。而Hepcidin水平無論是單因素還是多因素分析都不是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素(OR=1.135，P=0.859；OR=0.587，P=0.637)，見表2。

表2 30例ALL患者生存因素分析Table 2 Analysis of survival factors in 30 patients with ALL

2.3Hepcidin與HGB、CRP、Ferritin、Transferrin、EPO之間相關(guān)分析 Hepcidin水平與Ferritin水平呈正相關(guān)(r=0.466，P=0.010)，Hepcidin水平與HGB水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.407，P=0.026),Hepcidin水平與EPO水平、CRP水平和Transferrin水平無相關(guān)性(P=0.442、0.293、0.699)

3 討 論

白血病是最常見的兒童惡性腫瘤，占發(fā)病率的30%，而其中最常見的為ALL[1]。ALL因其高發(fā)病率成為威脅兒童健康的重要疾病。隨著治療方案的優(yōu)化及新藥的研發(fā)，兒童ALL的生存率逐漸提高[2]，生存質(zhì)量越來越受到關(guān)注[3]。貧血是ALL常見的臨床表現(xiàn)，不僅影響了患者的生存質(zhì)量，也是導(dǎo)致疾病預(yù)后不良的因素。而貧血的機(jī)制除了腫瘤浸潤之外還與鐵穩(wěn)態(tài)紊亂有關(guān)。

Hepcidin是肝臟合成的一種抗菌多肽，其編碼基因是位于人類19號(hào)染色體長臂的HAMP(hepcidin antimicrobial peptide)基因，是機(jī)體鐵代謝負(fù)調(diào)節(jié)的重要蛋白，通過與小腸黏膜細(xì)胞表面的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，促膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白使降解，減少鐵的吸收，使血漿內(nèi)鐵缺乏[4]。Hepcidin水平在某些疾病中被證實(shí)是影響治療及預(yù)后的因素[5]，而我們前期的研究也證實(shí)兒童AL患者血清鐵Hepcidin水平高于健康對(duì)照[6]，但是Hepcidin水平是否影響兒童ALL的預(yù)后目前罕見報(bào)道，因此我們對(duì)30例ALL患者，按初診時(shí)Hepcidin水平分為高水平和低水平2組，進(jìn)行了長達(dá)5年的隨訪，結(jié)果顯示雖然2組患者初診血清Hepcidin水平存在顯著差異，但是從長期隨訪結(jié)果來看，2組患者的生存曲線并沒有差異。為進(jìn)一步探討Hepcidin對(duì)ALL兒童預(yù)后的影響，我們應(yīng)用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行了單因素及多因素分析，單因素的結(jié)果顯示Hepcidin水平并不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，而年齡則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高年齡是影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，這與我們臨床觀察到的結(jié)果一致。在臨床實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)大于10歲患者的預(yù)后較小年齡患者預(yù)后相對(duì)較差[7]，但是對(duì)于我們研究的病例，年齡因素并沒有導(dǎo)致最終生存曲線的差異，因此又進(jìn)行了多因素的分析，結(jié)果顯示在考慮了危險(xiǎn)度分級(jí)，感染等情況之后，年齡并沒有成為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素。而Hepcidin水平無論是單因素分析還是多因素分析都不能成為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，這與生存分析的結(jié)果一致。目前關(guān)于Hepcidin在AL中預(yù)后的研究較少，我國學(xué)者在2019年發(fā)表的文章中指出Hepcidin水平在AL緩解和未緩解組之間存在差異，但結(jié)果僅通過組間差異比較和相關(guān)分析得出，未進(jìn)行長期隨訪，因此不能推斷遠(yuǎn)期預(yù)后[8]。兒童ALL的遠(yuǎn)期預(yù)后受多因素的共同影響，比如化療方案的選擇，患者依從性，甚至患者的營養(yǎng)狀態(tài)等都可能成為影響預(yù)后的因素，本研究顯示在綜合其他研究因素以后Hepcidin水平并沒有成為影響患者預(yù)后的因素，這可能與我們后期治療中嚴(yán)格控制患者輸血次數(shù)有關(guān)，雖然沒有在ALL患者中統(tǒng)計(jì)輸血次數(shù)與Hepcidin水平的相關(guān)性，但是再生障礙性貧血患者的研究結(jié)果顯示Hepcidin水平確實(shí)與輸血量相關(guān)[9]。

鐵超載是慢性病貧血的主要因素[10-11]，最新研究發(fā)現(xiàn)在AL患者中同樣存在鐵超載的問題，由于反復(fù)接受紅細(xì)胞輸注，約1/4的患者存在鐵超載的問題[12]。研究證實(shí)Hepcidin生成不足是形成鐵超載的的根本原因[4]。為了分析Hepcidin在兒童ALL中的臨床意義我們進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果證實(shí)Hepcidin與Ferritin水平呈正相關(guān)。Ferritin是機(jī)體內(nèi)貯存鐵的主要形式。Hepcidin可以抑制胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)出，造成細(xì)胞內(nèi)大量鐵堆積，引起Ferritin的表達(dá)增加，造成鐵超載的狀態(tài)。我們同樣觀察到在ALL患者中血清Ferritin普遍高于正常水平，這提示在ALL患者中可能存在鐵超載的問題。而Hepcidin與Ferritin同向升高在一定程度上解釋了ALL初診患者Hepcidin升高的問題。理論上，Hepcidin的升高造成血清循環(huán)鐵的減少，從而繼發(fā)引起轉(zhuǎn)鐵蛋白水平升高，但是在本研究結(jié)果顯示30例患者中有27例轉(zhuǎn)鐵蛋白水平降低，這一反常現(xiàn)象可能是腫瘤性貧血發(fā)生的機(jī)制之一。

已知白細(xì)胞介素6和EPO可以調(diào)節(jié)Hepcidin的表達(dá)[13]，其中EPO可能通過JAK/STAT通路來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)。ALL患者普遍存在貧血，而本研究也發(fā)現(xiàn)Hepcidin與HGB水平呈反比。理論上慢性貧血會(huì)造成機(jī)體EPO表達(dá)水平的升高，而EPO會(huì)負(fù)性調(diào)節(jié)Hepcidin的表達(dá)[14]。但是本研究并沒有發(fā)現(xiàn)HGB水平和EPO水平的具有相關(guān)性,分析原因可能是由于ALL患者的貧血多為急性貧血，機(jī)體代償反應(yīng)不完善。而相關(guān)性分析顯示Hepcidin與EPO水平無相關(guān)性，這一結(jié)果說明EPO對(duì)Hepcidin負(fù)反饋調(diào)節(jié)的失敗可能是兒童ALL患者貧血的另一個(gè)機(jī)制。

IL-6除能調(diào)節(jié)Hepcidin的合成并造成鐵穩(wěn)態(tài)的紊亂外，還能通過影響EPO軸導(dǎo)致貧血的發(fā)生[15]，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)IL-6與Hepcidin表達(dá)呈正相關(guān)。IL-6是炎癥反應(yīng)中重要的促炎因子[16]，而炎癥所引發(fā)的貧血也是兒童白血病貧血最常見的原因之一。ALL患者在疾病初期常合并感染，尤其是細(xì)菌感染，為了探討ALL患者高Hepcidin水平是否與感染有關(guān)，本研究分析了CRP與Hepcidin的相關(guān)性，結(jié)果顯示CRP與Hepcidin無相關(guān)關(guān)系，這就提示ALL患兒Hepcidin和IL-6高表達(dá)并不是感染的結(jié)果，而是疾病本身引起的。

綜上所述，在兒童ALL患者中血清Hepcidin水平并不能作為影響預(yù)后的獨(dú)立因素，而Ferritin的表達(dá)水平與血清Ferritin呈正相關(guān)，與HGB水平呈負(fù)相關(guān)，提示兒童ALL中鐵代謝異常可能是導(dǎo)致患者貧血的一個(gè)重要原因。當(dāng)然我們所有結(jié)果都是基于入組病例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出的，由于病例數(shù)的限制，可能存在一定的局限性，但是以Hepcidin為代表的的鐵代謝指標(biāo)的異常確實(shí)在兒童ALL中起到重要作用，需要引起大家重視。