新生兒窒息后腦損傷外周血S100β、GFAP的變化及臨床意義

陳 俊，嚴 爭，劉 凡

(福建醫科大學附屬福州市第一醫院兒科，福建 福州 350009)

新生兒窒息是圍產期常見疾病，也是新生兒科收治主要病種之一，新生兒窒息后腦損傷可導致神經系統后遺癥、殘疾，甚至死亡[1-5]。因此，早期預測新生兒腦損傷顯得尤為重要。近年來，國內新生兒腦損傷的診斷和評估仍主要依據腦電圖、頭顱影像學檢查(MRI或CT)、顱腦彩色超聲等，但這些手段存在滯后性，重癥、需呼吸機輔助呼吸、生命體征不穩定、不宜搬動者無法及時行頭顱MRI或CT檢查，且CT輻射量大、不能床旁檢查；顱腦彩色超聲可床旁檢查，但對矢狀旁區損傷不敏感；近些年新興起的新生兒振幅整合腦電圖(amplitude integrated electroencephalogram,aEEG)檢查便捷、經濟，可床旁長時間監測腦功能，但許多基層醫院尚未配備此類設備，從而錯過最佳治療時間窗，遺留腦癱或精神發育遲緩等神經系統后遺癥[6-7]。新生兒腦損傷受多種因素影響，近年來研究提出的有鈣結合蛋白S100β、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、血清腦鈉肽、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)等。S100β水平與缺氧缺血性腦病、腦白質損傷等具有相關性，且與窒息程度呈正相關[8-10]；中樞神經系統疾病患者體液中GFAP水平增高，GFAP水平可作為判斷腦損傷病情的特異性標志物。S100β、GFAP都屬于神經特異性蛋白，在中樞神經系統損傷修復以及發育過程中發揮了重要的作用。目前國內S100β、GFAP檢測對新生兒腦損傷預測意義的研究報道尚少。本研究通過檢測不同程度窒息新生兒血清中S100β、GFAP水平的變化，以期為早期預測腦損傷提供新思路和觀點，減少新生兒腦損傷的不良結局。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3—10月于我院出生的新生兒100例。其中，輕度窒息新生兒(輕度窒息組)38例、重度窒息新生兒(重度窒息組)16例、無窒息史及心血管系統疾病的正常新生兒(對照組)46例。輕度窒息組男性20例，女性18例，胎齡(37.5±2.5)周，出生體重(2 806±319)g；剖宮產18例，順產20例；入院日齡0.5～1.5 d；重度窒息組男性8例，女性8例，胎齡(37.6±2.1)周，出生體重(2 799±290)g；剖宮產6例，順產10例；入院日齡0.5～1 d；對照組男性23例，女性23例，胎齡(38.2±1.2)周，出生體重(2 810±291)g；剖宮產31例，順產15例；入院日齡0.5～3 d。3組新生兒性別、胎齡、出生體重、分娩方式、日齡差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究符合倫理學標準，經醫院倫理委員會審核批準通過，所有家屬均知情同意并簽署知情同意書。

納入標準：孕母無并發癥或內科疾病，新生兒性別不限。排除標準：先天性畸形、先天性腦發育異常、顱內感染、有嚴重并發癥等新生兒。

1.2診斷標準 窒息診斷標準及分度參照2016年新生兒窒息診斷的專家共識[11]，①產前有可能導致窒息的高危因素；②1 min或5 min Apgar評分<7分，仍未建立有效自主呼吸；③臍動脈血氣分析pH<7.15；④排除其他引起低阿氏評分的病因。②～④為必要條件，①為參考指標。根據“雙軌制”窒息分度標準：①輕度窒息，1 min或5 min阿氏評分<7分，臍動脈血氣分析pH<7.2；②重度窒息，1 min或5 min阿氏評分<5分，臍動脈血氣分析pH<7.0。

新生兒腦損傷，主要包括新生兒缺氧缺血性腦病、早產兒腦損傷(腦室周圍-腦室內出血、腦室周圍白質軟化)。參照2015年中華醫學會兒科學分會新生兒學組制定的新生兒缺氧缺血性腦病診斷標準、2012年中國醫師協會新生兒專業委員會早產兒腦損傷診斷與防治專家共識，①有可引起腦損傷的高危因素；②神經系統異常臨床表現；③影像學檢查；④腦功能監測；⑤除外其他原因引起的腦損害。54例窒息新生兒中18例出生后出現易激惹、肌張力高、抖動、昏迷、抽搐等表現，生后3～5 d行頭顱MRI、頭顱CT或顱腦彩色超聲檢查,其中發現顱內出血和(或)新生兒缺氧缺血性腦病18例(輕度窒息10例,重度窒息8例)。分為腦損傷組18例、非腦損傷組36例。

1.3指標標測 所有新生兒在出生后4 h內取外周靜脈血2～3 mL，采血時避免溶血。采用雙抗二步夾心法酶聯免疫吸附試驗檢測S100β和GFAP水平。往包被微孔中依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，用TMB顯色，TMB在過氧化物酶及酸的作用下先后轉化為藍色、黃色。用酶標儀在450 nm波長測定吸光度，計算樣品水平。試劑盒均由福建省艾迪康醫學檢驗中心提供。所有操作均由同一人嚴格按照試劑盒步驟執行。

窒息新生兒3 d后進行20項行為神經測查方法(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)，分為行為能力(6項)、被動肌張力(4項)、主動肌張力(4項)、原始反射(3項)、一般估價(3項)5個部分。每項評分分3個分度：0分、1分、2分，滿分40分，35分以下為異常。

1.4統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件處理數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗，相關性分析采用Spearman法，影響因素確定采用二元Logistic回歸分析，采用ROC曲線分析S100β、GFAP對評估新生兒腦損傷的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組新生兒血清S100β、GFAP檢測比較 輕度窒息組、重度窒息組S100β水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；輕度窒息組與重度窒息組S100β水平差異無統計學意義(P>0.05)，3組GFAP水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組S100β、GFAP水平比較Table 1 Comparison of S100β and GFAP contents among three groups

2.2腦損傷組和非腦損傷組S100β、GFAP水平及NBNA評分比較 腦損傷組S100β水平明顯高于非腦損傷組，NBNA評分低于非腦損傷組，差異有統計學意義(P<0.05)；腦損傷組與非腦損傷組GFAP水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 腦損傷組與非腦損傷組S100β、GFAP水平及NBNA評分比較Table 2 Comparison of S100β, GFAP and NBNA score between the brain injury group and the non-brain injury group in asphyxia newborn

2.3S100β、GFAP與NBNA評分相關性分析 Spearman相關分析結果顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關(rs=-0.306,P<0.05)，GFAP水平與NBNA評分無相關(rs=0.032,P>0.05)。

2.4Logistic回歸分析 以顱腦損傷(否=0，是=1)為因變量，以S100β(連續型變量)、GFAP(連續型變量)為自變量，進行二元Logistic回歸分析，結果顯示，S100β是新生兒腦損傷的影響因素(P<0.05)。見表3。

2.5S100β、GFAP對評估腦損傷的價值分析 繪制ROC曲線(圖1)，S100β評估腦損傷的AUC=0.755(95%CI：0.603～0.907)，根據約登指數0.556，找出陽性臨界值為1.595 μg/L，其診斷敏感度為77.8%，特異度為77.8%。GFAP的ROC曲線的AUC=0.488(95%CI：0.315～0.660)，根據約登指數0.139，找出陽性臨界值為3.120 μg/L，其診斷敏感度為16.7%，特異度為97.2%。見表4。

表3 S100β、GFAP對腦損傷影響的二元Logistic回歸分析Table 3 Binary Logistic regression analysis of effects of S100β and GFAP on brain injury

表4 S100β、GFAP水平對評估腦損傷的價值分析Table 4 Value analysis of S100β and GFAP Levels in evaluation of brain injury

圖1 腦損傷窒息新生兒S100β、GFAP檢測的ROC曲線分析

3 討 論

新生兒腦損傷臨床多隱匿或不典型，表現為易激惹、抖動、嗜睡、肌張力增高或低下、抽搐等，嚴重者可遺留腦癱、運動姿勢發育異常、智力低下、認知障礙、癲癇、視聽感官障礙等神經系統后遺癥。因新生兒腦損傷早期缺乏典型的臨床表征，且相關輔助檢查，如顱腦MRI/CT/彩色超聲、腦電圖等存在檢查滯后性，且相當一部分基層醫院配備不完善，故對臨床醫生來說，疾病早期檢測腦損傷標記物有利于腦損傷的判斷。

近年來，S100β在圍產兒腦損傷中的應用和研究得到國內外學者的廣泛關注。S100是從牛腦組織中分離出來的一種亞細胞組分，是能與鈣相結合的蛋白[12]。S100β蛋白是其主要成分之一，主要集中于中樞神經系統的星形膠質細胞(astrocytes,AS)、垂體前葉細胞[13]，并在非神經細胞中少量表達。中樞神經系統損傷時，在許多體液(如腦脊液、血液、尿液、羊水)中均可測得。雖然腦外組織中存在S100β，但血液S100β主要還是來自于血腦脊液屏障破壞后腦脊液S100β的外滲[14-15]。Winter等[16]提出，S100β穿透性較強，新生兒血腦屏障薄弱。腦損傷發生時，AS細胞的細胞膜被破壞，釋放S100β進入腦脊液，經血腦屏障進入血液，血清S100β水平快速升高[17]。研究表明，腦損傷可引起腦脊液和血清S100β水平顯著升高[18-19]。因S100β蛋白在多種體液中可測得，采集標本方便，對腦損傷診斷的敏感度及特異度均較高，故具有早期診斷價值。

本研究結果顯示，輕度窒息組和重度窒息組S100β水平高于對照組；腦損傷組S100β水平高于非腦損傷組；Spearman相關分析顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關；回歸分析顯示，S100β是新生兒腦損傷的影響因素，S100β高一個單位患兒出現腦損傷的可能性高14.43倍；S100β預測腦損傷的陽性臨界值為1.595 μg/L，敏感度為77.8%，特異度為77.8%。受窒息缺氧、缺血的影響，AS發生異常變化，S100β水平迅速升高，本研究標本均來源于出生4 h內外周血，提示在腦損傷早期4 h內，血清S100β變化就可被檢測出來，其單獨檢測具有很高的準確度、敏感度及特異度。本研究結果顯示，輕度窒息組與重度窒息組S100β差異無統計學意義，考慮與S100β半衰期短(2 h左右)及輕微腦損傷者病情不再進展有關。

本研究結果顯示，腦損傷組NBNA評分較低，非腦損傷組NBNA評分較高。Spearman相關分析顯示，S100β水平與NBNA評分呈負相關，S100β水平越高，NBNA評分越低。若患兒神經系統損傷嚴重，可嚴重影響日后生活質量，故外周血S100β早期檢測對新生兒腦損傷的判斷和防治具有十分重要的臨床意義。

GFAP是AS細胞骨架蛋白的特有成分，是其特征性標記物[20]。AS細胞死亡后，透過血腦屏障進入血液，與神經系統損傷及修復有關[21]。潘奇峰[22]研究發現，新生兒缺氧缺血性腦病、腦室周圍白質軟化疾病與AS細胞數量增多有密切關系。在缺氧缺血條件下，AS細胞從靜息態轉變為活化態，通過神經生長因子、5-羥色胺受體等調控后分泌GFAP入血，使血中AS細胞增多，以穩定缺血組織形態的完整。中樞神經系統創傷或炎癥后，GFAP 表達增加，其體液濃度是評估AS細胞增多癥、AS細胞激活的重要手段，可間接反映腦損傷的程度，神經損傷越嚴重，濃度越高[23]。本研究結果顯示，對照組、輕度窒息組、重度窒息組GFAP差異無統計學意義；GFAP與NBNA無相關性；GFAP預測腦損傷的敏感度為16.7%，特異度為97.2%。高玉松等[20]研究表明，顱腦損傷后1 h血清GFAP升高，20 h到達峰值，隨著受損AS細胞數量衰亡、釋放GFAP逐漸減少，釋放入血的GFAP逐漸減少，若顱腦損傷12～24 h內檢測GFAP正常者可排除腦損傷。張麗勇等[24]研究大鼠原發性腦干損傷模型，結果表明，腦干損傷30 min后，GFAP開始增加，損傷后48 h達到峰值并開始降低，GFAP表達具有明顯規律性。本研究GFAP的檢測結果表示敏感度低，但特異性高，單獨檢測預測腦損傷準確性不高，考慮以下幾點：①本研究標本于出生后4 h內采集，窒息缺氧、缺血早期，AS細胞尚未凋亡，分泌GFAP不足，采集標本時外周血中GFAP尚未達峰值，陽性檢出率低，提示此類窒息缺氧的新生兒，可考慮出生后12～24 h，一般不超過2 d，再采集GFAP檢測，本研究結果對于臨床醫生關于采集時間的選擇具有一定臨床意義；②中樞神經系統受損時，GFAP從損傷的AS細胞中溢出，經過細胞間隙，透過血腦屏障進入血液，從而外周血GFAP水平升高，外周血GFAP的檢出時間相對于腦脊液來說，前者滯后于后者，提示臨床醫生，在窒息缺氧早期，若能采集腦脊液進行GFAP檢測，可能會提高敏感度；③通過ROC曲線分析，GAFP檢測敏感度低，陽性檢出率低，但其特異度高，若能檢測到濃度升高，有一定臨床意義；④樣本量少，仍需在日后此類研究中擴展樣本量，進一步增加數據準確度。

綜上所述, 血清S100β是一種高敏感度、高特異度、高準確度的腦損傷生化標志物，有助于新生兒窒息的診斷和判斷新生兒窒息后的腦部進展和結局,為預測新生兒腦損傷提供了客觀依據。GFAP在生后4 h內檢測準確性低，但對腦損傷的特異度高，不建議太早檢測。S100β、GFAP均為腦損傷血清學標志物，在采集時間上，臨床醫生要考慮其動態變化規律，選擇適宜的采集時間，以提高診斷的準確性，為早期預測新生兒腦細胞代謝異常提供客觀依據。但由于本研究的時間及樣本量有限，可能與實際有一定的偏差，且未能跟蹤隨訪進一步研究。因此有待更大樣本量及長期隨訪研究來證實。