葒草提取物對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血的作用及機(jī)制*

孫佳，潘潔，秦蘭,，楊淑婷,，劉春花，徐興蓮，王永林，陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 &省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

葒草為蓼科植物葒草(PolygonumorientaleL.)的干燥果穗及帶葉莖枝，性平、味辛，歸肝脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕和活血消腫的功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、疝氣及瘡腫等，收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，葒草在貴州省分布廣泛，為民間常用于緩解胸痛、胸悶及氣短等急性心肌缺血癥狀的治療[1-3]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道表明，葒草藥材中含有黃酮類、木質(zhì)素類、甾體皂苷類及二苯乙烯類等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗心肌缺血和抗缺氧、增加心肌營(yíng)養(yǎng)血流量、保護(hù)梗死心肌、抗血栓、抗氧化及抗菌等多種藥理活性[4-7]。本課題組前期已開(kāi)展葒草藥用部位的篩選和化學(xué)成分研究，確定了葒草的有效部位為水煮醇沉、正丁醇萃取80%乙醇洗脫段，其含量較高的主要活性成分為黃酮類化合物，如葒草素、異葒草素及牡荊素等[8-9]，并明確了其在細(xì)胞水平上對(duì)體外H9C2細(xì)胞有抗氧化作用[10]。心肌缺血(myocardial Ischemia，MI)是指冠狀動(dòng)脈的供血不能滿足心肌耗氧量的需求，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常的一種病理綜合征[11-13]。缺血性心臟病或突發(fā)性心臟病是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的致死和致殘的單一因素，MI為冠心病、心絞痛及心肌梗死等多種疾病的共同病理生理機(jī)制[14-17]。研究表明，大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO) 可因增加心肌耗氧而造成大鼠急性MI，其主要機(jī)制是通過(guò)強(qiáng)烈收縮冠狀動(dòng)脈，造成心肌組織急性供血不足，并能增加外周阻力和心臟負(fù)荷，其心電圖、心肌酶學(xué)及組織病理學(xué)變化均類似于人類MI致急性心肌梗死的病變特征[18-20]。因此本研究選擇ISO誘導(dǎo)的大鼠急性MI為模型，通過(guò)觀察不同時(shí)間葒草提取物對(duì)急性MI大鼠的心電圖、血清酶學(xué)指標(biāo)及心肌組織形態(tài)學(xué)的影響，探討葒草對(duì)MI損傷的作用、藥物起效時(shí)間及其作用機(jī)制，為葒草產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Sprague Dawley (SD)大鼠30只，雄性，體質(zhì)量為(250±20)g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0008]。

1.1.2主要藥品與試劑 葒草藥材購(gòu)買自貴州省六盤(pán)水，由貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為蓼科植物葒草的干燥全草，標(biāo)本存于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，葒草提取物由該室提取制備。復(fù)方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)G17A007)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及磷酸肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鹽酸ISO(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)100203)，水合氯醛(純度≥0.99，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3主要儀器 四通道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，680型酶標(biāo)儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，微量移液器(德國(guó)Eppendorf股份公司)，超低溫冰箱和MD-100自動(dòng)生化分析儀(美國(guó) Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模和分組 30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)均分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥復(fù)方丹參片對(duì)照組(1 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照組)、葒草提取物低劑量組(3.2 g/kg，葒草低劑量組)及葒草提取物高劑量組(6.4 g/kg，葒草高劑量組)；除正常組外，其他各組大鼠分別以50 mg/kg劑量皮下注射ISO生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射2 d制備急性MI大鼠模型；正常組大鼠注射等體積的生理鹽水。造模完成后，葒草低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組均給予相應(yīng)治療藥物灌胃，2次/d，連續(xù)3 d；模型組和空白對(duì)照組大鼠灌胃等體積蒸餾水(15 mL/kg)。

1.2.2心肌電生理指標(biāo)測(cè)定 各組大鼠末次給藥后，腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，用針狀電極插入左下肢、左上肢和右上肢連續(xù)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，觀察給藥后0.5、2.0及6.0 h時(shí)各組大鼠的心電圖(electrocardiogram，ECG)變化，測(cè)量ST段的偏移程度。

1.2.3血清酶學(xué)指標(biāo) 各組大鼠于末次給藥后0.5、2.0及6.0 h，經(jīng)尾靜脈取血約1 mL置塑料離心管中，4 ℃靜置2 h，4 ℃、3 000 r/ min離心 10 min，吸取上層血清，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用MD-100自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中LDH、SOD及CK-MB水平。

1.2.4組織形態(tài)學(xué)指標(biāo) 各組大鼠于末次取血結(jié)束后，取出心臟、洗凈血液、立即放入含20倍組織體積的4%多聚甲醛溶液中固定，16～24 h后脫水、包埋及制作5 μm石蠟切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ECG ST段的變化

與正常組相比，MI模型組大鼠ECG ST段明顯抬高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠ECG ST段均降低(P<0.05或P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠ECG ST段與模型組相比，亦明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠ECG 不同時(shí)點(diǎn)ST段變化Tab.1 Changes of ST segment in ECG of rats in each group at different time points

2.2 血清SOD

與正常組相比，模型組大鼠血清SOD水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清SOD水平升高(P<0.05)，但給藥后各時(shí)間點(diǎn)血清SOD水平升高程度無(wú)差異(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠血清SOD水平與模型組相比亦升高(P<0.01)，且給藥后各時(shí)間點(diǎn)血清SOD水平也無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清SOD水平Tab.2 Changes of SOD content in serum of rats in each group at different time points

2.3 血清LDH

與正常組相比，模型組大鼠血清LDH明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清LDH明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且給藥后2.0 h血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組的大鼠血清中LDH水平與模型組相比亦明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且給藥后2 .0 h的血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各時(shí)間點(diǎn)LDH降低程度與葒草提取物各組較一致。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清LDH水平Tab.3 Changes of LDH content in serum of rats in different groups at different time points

2.4 血清CK-MB

與正常組相比，模型組大鼠血清CK-MB明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清中CK-MB降低(P<0.05)，且降低程度隨時(shí)間的增加而減小；陽(yáng)性藥對(duì)照組的大鼠血清中CK-MB與模型組相比亦降低(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清CK-MB水平Tab.4 Changes of CK-MB content in serum of rats in different groups at different time points

2.5 心肌組織組織學(xué)

正常組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)，胞核清晰，肌纖維排列整齊有序。模型組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死和出血，肌纖維排列紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞輕度增生及血管增生充血。用藥各組大鼠心肌細(xì)胞病變較模型組減輕，其中陽(yáng)性對(duì)照組組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間隙水腫減輕，成纖維細(xì)胞增多間質(zhì)內(nèi)偶見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；葒草低劑量組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，肌束間隔略增寬，細(xì)胞間隙水腫減輕，間質(zhì)內(nèi)偶見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及灶性心肌出血；葒草高劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，輕中度空泡樣變性，肌束間隔中度增寬，輕度水腫，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及灶性心肌變性和出血。見(jiàn)圖1。

正常組 模型組 陽(yáng)性對(duì)照組 葒草低劑量組 葒草高劑量組圖1 各組大鼠心肌組織的病理形態(tài)學(xué)特征(HE，×100)Fig.1 The pathomorphological characteristics of myocardial tissues of rats in each group(HE，×100)

3 討論

本研究采用ISO皮下注射的方法誘導(dǎo)大鼠急性MI，異丙腎上腺素是經(jīng)典的β1、β2受體激動(dòng)藥，其能夠興奮心臟的β1受體，能夠通過(guò)收縮冠狀動(dòng)脈、使心率加快及傳導(dǎo)加速，從而妨礙冠狀動(dòng)脈血灌注流量造成心肌耗氧量增加，心臟負(fù)荷過(guò)重，心肌微循環(huán)障礙，冠狀動(dòng)脈痙攣，心肌梗死樣變，引起MI[21-22]。ECG 是缺血心肌變化的敏感指標(biāo)，當(dāng)大鼠心肌產(chǎn)生心肌損傷及壞死時(shí)，會(huì)出現(xiàn)ECG ST段的異常改變，所以MIST段的變化幅度可基本反映MI的嚴(yán)重程度，因此ST段的偏移可作為缺血程度的定量指標(biāo)[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，葒草提取物組可顯著降低由于急性MI所致的大鼠ECG ST段的抬高，且效果隨著給藥后時(shí)間的增加而增大，說(shuō)明葒草提取物可有效改善大鼠MI后導(dǎo)致的ECG 異常改變，且作用效果較強(qiáng)且持久。

當(dāng)MI產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)酶大量釋放入血液，而血清中心肌酶CK-MB、LDH等的高低可反映缺血心肌的損傷程度[24]，其中 CK-MB是磷酸肌酸激酶CK的4種同工酶之一，95%的CK-MB存在于心肌細(xì)胞質(zhì)中，能催化肌酸和腺苷三磷酸生成磷酸肌酸和腺苷二磷酸，該可逆性反應(yīng)所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能鍵，是肌肉收縮能量的直接來(lái)源[25-26]；CK-MB釋放數(shù)量的變化與心肌損傷程度呈正相關(guān)，是反映心肌損傷最敏感的指標(biāo)之一[27]。LDH 是糖酵解途徑中的重要酶，位于細(xì)胞質(zhì)，廣泛分布于各組織中，心肌居第2位[28-29]。當(dāng)MI、心肌細(xì)胞損傷及細(xì)胞膜破壞時(shí)，即使少量心肌組織損傷或壞死所釋放的酶，都足以引起血清中該酶活性的升高[17]，故其活性是反映MI損傷的重要指標(biāo)之一。當(dāng)MI缺氧時(shí)，由于產(chǎn)生大量的過(guò)氧化物，導(dǎo)致SOD大量消耗，使其活力降低，所以通過(guò)檢測(cè)SOD活性可以評(píng)估組織內(nèi)自由基代謝情況及MI程度[30]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，葒草提取物降低了MI所致的ECG ST段抬高，減少了CK-MB和LDH的釋放，提高了血清SOD活性，因此提示對(duì)急性MI具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與保護(hù)心肌細(xì)胞功能、提高心肌抗氧化能力、清除氧自由基有關(guān)。通過(guò)觀察不同時(shí)間點(diǎn)的藥效結(jié)果，可見(jiàn)模型大鼠給藥0.5 h就有顯著的治療效果，說(shuō)明葒草提取物具有起效迅速的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，研究顯示大鼠血清中SOD活性和CK-MB隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高、LDH先降低后升高，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能與上述藥效指標(biāo)相關(guān)的化合物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)過(guò)程改變有關(guān)。從劑量上看，低劑量組大鼠藥效比高劑量組更好，高劑量組心肌組織病理切片可見(jiàn)組織空泡化，可能是因?yàn)楦邉┝拷M的葒草提取物用量超過(guò)了它本身正常的量效關(guān)系。

綜上所述，通過(guò)ISO致急性MI模型，大鼠出現(xiàn)典型的MI現(xiàn)象，同時(shí)血液中LDH和CK-MB升高，SOD降低，表示造模成功；而葒草提取物低、高劑量組均能改善MI的狀態(tài)，藥效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，低劑量組藥效最好，本研究初步闡明了葒草提取物對(duì)MI損傷具有保護(hù)作用。