梗阻性黃疸大鼠脂質(zhì)代謝及肝型脂肪酸結(jié)合蛋白的變化*

李福堂，王惠群，楊大剛，孫誠誼，郭平平

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 肝膽外科,貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽 550000；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550000)

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ) 是肝膽外科常見疾病，是指肝內(nèi)毛細(xì)膽管、小膽管、肝膽管、肝總管或膽總管的機(jī)械性梗阻，導(dǎo)致膽汁排泄障礙、膽汁淤積，整個膽道系統(tǒng)壓力增高，膽紅素逆流入血而形成的組織黃染，主要病因是膽石癥和惡性腫瘤[1]。梗阻性黃疸病人可引起機(jī)體各器官的損害，其中肝臟損害最為嚴(yán)重，其損害機(jī)理包括胃腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥[2]、氧自由基的損傷作用[3]、能量代謝障礙[4]、機(jī)體免疫功能受損[5]、肝細(xì)胞凋亡[6]以及鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等，其中氧自由基的損傷及能量代謝障礙在OJ的脂質(zhì)代謝中起重要角色，脂質(zhì)過氧化是OJ器官損傷的最重要的機(jī)制之一。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver type fatty acid binding protein，L-FABP)在OJ過程中的表達(dá)與游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)代謝及肝臟氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，因此了解梗黃過程中脂質(zhì)代謝及L-FABP的變化對OJ患者的臨床治療具有重要意義，而OJ的脂質(zhì)代謝及L-FABP變化的研究鮮有報道。因此本研究期望通過建立OJ大鼠模型，檢測在OJ發(fā)生及進(jìn)展過程中脂質(zhì)代謝及L-FABP的變化，探討L-FABP在其中的作用，為OJ患者的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器、試劑

選取54只體質(zhì)量為(280±30)g的健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[許可證號SCXK(黔)2018-0001]；德國西門子公司西門子ADVIA2400全自動生化分析儀(德國西門子公司)，總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司)，上海科華東菱診斷用品有限公司甘油三脂檢測試劑盒(上海科華東菱診斷用品有限公司)，Rat low density lipoprotein(VLDL、FFA、OxLDL、Lp-X、L-FABP)ELISA Kit(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，完全隨機(jī)分成正常對照組(A組)、假手術(shù)組(B組)和膽總管結(jié)扎組(C組)共3組，每組18只。C組大鼠，均采用10%水合氯醛按3 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定、備皮，每組取6只大鼠，碘伏、75%乙醇消毒手術(shù)野；正中切口約3 cm，解剖肝蒂，游離出膽總管后，以2-0號絲線雙重結(jié)扎膽總管，關(guān)閉腹膜腔，切開處常規(guī)消毒；B組,大鼠僅游離膽總管，不結(jié)扎，其余操作同C組；A組，不作任何處理。分別于術(shù)后第5、12和19天，每組取6只大鼠固定后，切開一側(cè)腹股溝部位的皮膚，分離暴露股動脈，再用血管鉗將其挑起，用剪刀剪斷血管后直接用常規(guī)生化試管及帶有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管取血，每只大鼠采全血3～4 mL檢測下列指標(biāo)。

1.2.2大鼠一般情況及肝臟組織肉眼觀察 觀察3組大鼠3個時間點(diǎn)的一般情況(大鼠的精神、食欲、皮膚及鞏膜的顏色、大小便顏色)、解剖后膽總管結(jié)扎部位以及肝臟顏色、硬度。

1.2.3檢測指標(biāo)及方法 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)用西門子ADVIA2400全自動生化分析儀測定。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)、氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)、阻塞性脂蛋白X(lipoprotein X，LPx)分別按照ELISA試劑盒說明書測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察和肝臟組織肉眼觀察

觀察整個實驗過程中A、B、C組一般情況，A組大鼠一般情況及肝臟組織肉眼觀察無特殊；B組術(shù)后1～4 d僅有食欲不振，精神稍差，體重稍減少，后逐漸恢復(fù)和A組一樣；C組術(shù)后2～3 d，大鼠出現(xiàn)皮膚、鞏膜黃染并逐漸加深，尿色深黃，食欲減退，體質(zhì)量逐漸減輕。開腹后見A組和B組腹腔無特殊,而C組大鼠可見術(shù)后5 d近肝門部膽總管囊狀擴(kuò)張充滿膽汁，術(shù)后12 d肝臟彌漫性腫大、呈黃褐色，術(shù)后19 d肝臟質(zhì)地變硬。見圖1。

2.2 術(shù)后第5天血清LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL

C組大鼠血清LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL表達(dá)高于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而B組與A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

注：a為A組正常肝臟組織；b為A組正常的膽總管；c為B組肝臟；d、e為術(shù)后5 d膽總管及肝臟，結(jié)扎后膽總管囊性擴(kuò)張，肝臟呈黃褐色；f為術(shù)后12 d膽總管及肝臟；g為術(shù)后19 d膽總管及肝臟。圖1 A、B、C組肝臟組織肉眼觀察Fig.1 Visual inspection of hepatic tissue of rats in Goup A ,B,and C

表1 各組大鼠血清中LPx、ALT、AST、TBIL及DBIL的變化Tab.1 Comparison of serum LPx,ALT,AST,TBIL,and DBIL of rats in each

2.3 血脂指標(biāo)

結(jié)果顯示，術(shù)后第5天，C組TC、TG、HDL以及LDL明顯高于A組及B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后第12天，C組TC、LDL高于A組及B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第19天，C組TC、LDL、VLDL、Ox-LDL高于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FFA低于A組和B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)的變化Tab.2 Changes in lipid profile of rats in each group

2.4 血清L-FABP水平

術(shù)后第5天和第12天，C組術(shù)后血清中L-FABP高于A組及B組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第19天，A組與C組、B組與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠3個時間點(diǎn)L-FABP水平Tab.3 Changes of serum L-FABP of rats in each group at three time points

3 討論

膽道結(jié)扎術(shù)后5 d，C組大鼠的TC明顯增高，其原因為：(1)膽汁酸能反饋抑制7a-羥化酶,抑制膽汁酸合成,使TC代謝去路受阻,在血中積聚；(2)膽道壓力增高[7],TC隨膽汁逆流入血,使血中TC 的含量增高;(3)梗阻性黃疸，肝功能受損，肝臟合成膽紅素減少，消耗膽固醇減少。血清總膽固醇升高，隨著梗阻時間延長，膽總管內(nèi)壓力不斷增加，膽管直徑不斷增寬，當(dāng)膽管內(nèi)壓力同膽管壁的回應(yīng)力相等時，膽管內(nèi)壓力不再增加[8]，致使TC隨膽汁逆流入血減少，同時體內(nèi)消耗部分TC；(4)L-FABP在肝中膽固醇聚集有重要調(diào)節(jié)作用[9],此為C組術(shù)后12和19 d時逐漸下降原因所在。正如Martin等[10]用敲除L-FABP雄性小鼠研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇膳食后，L-FABP可能成為雄性小鼠膽汁酸合成、肝中膽固醇聚集的重要調(diào)節(jié)因素。

膽道結(jié)扎術(shù)后第5天C組血清中TG明顯增高，后逐漸降低，第12、19天降為正常；研究表明，TG在梗阻早期是增加，L-FABP的基因多態(tài)性也可造成TG升高[11]，肝臟嚴(yán)重?fù)p害后TG降低。梗阻性黃疸病人還同時存在高TG血癥，可能與TG血清清除率降低有關(guān)[12]。血清中FFA逐漸減少，原因為：(1)膽總管結(jié)扎后食欲不振，造成攝入不足；(2)膽道梗阻時，膽汁不能順利排入腸道，胰脂肪酶無法被激活，導(dǎo)致脂肪消化吸收不良；(3)脂肪動員加速，使體內(nèi)FFA減少。L-FABP膜間的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)需要3步，供體膜分離、水相擴(kuò)散和受體膜連接，每步都是雙向可逆的，其由供體到受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)有3種機(jī)制[13]:(1)脂肪酸自動發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn),但其轉(zhuǎn)運(yùn)率很低；(2)由非膜激活型受體協(xié)助,擴(kuò)散是通過增加溶解的脂肪酸濃度來進(jìn)行的；(3)由膜激活型受體介導(dǎo)發(fā)生,促進(jìn)與受體膜作用過程中的分離與重新結(jié)合。

TC在血液中與載脂蛋白(apo)結(jié)合，以可溶性脂蛋白的形式存在，其中3/4存在于LDL中，1/4存在于HDL中[14],故HDL、LDL與TC的變化趨勢相似，膽道結(jié)扎術(shù)后5 d時C組血清中含量最高，后逐漸下降，LDL占TC量多，LDL降低緩慢。LDL在膽道結(jié)扎術(shù)后5 d時升高還與梗阻性黃疸時血清中出現(xiàn)異常LDL即脂蛋白x有關(guān)。HDL的代謝受許多生理和病理條件的影響，在梗阻性黃疸病人，肝靜脈系統(tǒng)內(nèi)的膽鹽濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于可造成細(xì)胞損害的濃度(3～6 mmol/L),因此膽鹽破壞效應(yīng)增強(qiáng)，HDL穩(wěn)定性降低[15]。梗阻性黃疸時卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)活性降低、合成減少,使膽固醇酯化出現(xiàn)障礙，HDL生成減少。HDL與脂多糖(LPS)的結(jié)合能有效地封閉LPS的活性中心，競爭性抑制LPS與其受體結(jié)合，降低LPS對靶細(xì)胞的激活作用，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而緩解LPS引起的炎癥反應(yīng)[16],這個機(jī)制會使HDL分解增加、濃度下降，而且HDL降幅與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。

膽總管結(jié)扎術(shù)后第5天和12天，C組Ox-LDL與A組及B組無明顯差異，隨梗阻時間延長，肝臟損害加重，術(shù)后第19天時梗阻性黃疸大鼠出現(xiàn)肝硬化，C組Ox-LDL明顯高于A組及B組。研究發(fā)現(xiàn)梗阻性黃疸改變了機(jī)體氧化應(yīng)激的平衡狀態(tài)，能加劇肝臟纖維化的發(fā)展[18]。脂質(zhì)是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激的主要作用底物，而 Ox-LDL又是脂質(zhì)氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂和平滑肌細(xì)胞的增生。以往認(rèn)為Ox-LDL是動脈粥樣硬化的重要危險因素[19],近年來研究發(fā)現(xiàn) Ox-LDL能促進(jìn)膠原纖維的降解，使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生紊亂，而肝臟的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和枯否細(xì)胞中也存在 Ox-LDL特定的受體，Ox-LDL可能促進(jìn)肝臟纖維化甚至誘導(dǎo)肝硬化[20]。

L-FABP是肝臟內(nèi)唯一表達(dá)的脂肪酸結(jié)合蛋白，其結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸。肝臟細(xì)胞中L-FABP主要在肝細(xì)胞胞質(zhì)中,在正常血清中L-FABP含量較低,膽總管結(jié)扎后肝細(xì)胞受損，肝細(xì)胞膜通透性變化可使其快速溢出質(zhì)量較小的L-FABP，釋放入血，使血漿L-FABP濃度上升，因此在術(shù)后5 d時L-FABP升高，并在12 d時達(dá)到高峰。隨梗阻性黃疸時間延長，肝臟嚴(yán)重?fù)p害時，肝臟合成分泌L-FABP減少，進(jìn)而血漿中的L-FABP濃度減少，至19d時明顯低于5d與12d的濃度，與A組及B組無明顯差異。目前研究成果，L-FABP參與脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制主要有[21]：(1)通過對脂肪酸的調(diào)控來影響脂質(zhì)代謝，將脂肪酸從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到代謝場所，比如L-FABP結(jié)合長鏈脂肪酸并轉(zhuǎn)運(yùn)至β氧化場所及磷脂和TG的合成部位；(2)影響脂質(zhì)代謝酶的活性來調(diào)控脂質(zhì)代謝，L-FABP增強(qiáng)脂質(zhì)代謝酶的活性，提高對脂肪的吸收能力；(3)對激素的介導(dǎo)作用來影響脂質(zhì)代謝；(4)L-FABP能維持FFA的平衡，L-FABP結(jié)合脂肪酸，使體內(nèi)FFA維持相對平衡狀態(tài)；(5)L-FABP具有維持脂質(zhì)代謝內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，作為脂肪酸和胰腺輔酶A生化反應(yīng)的輔助因子影響胞質(zhì)內(nèi)脂肪酸分室化，并緩沖輔酶A級長鏈脂肪酸對機(jī)體的副作用。

此外，L-FABP的改變與氧化應(yīng)激狀態(tài)及抗氧化能力的改變有關(guān)，在梗阻性黃疸5～12 d時，為對抗氧化應(yīng)激的加重，機(jī)體的L-FABP增加。Yan等[22]用L-FABP的cDNA轉(zhuǎn)錄模型證實了L-FABP有抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)與缺乏L-FABP肝細(xì)胞比較，含L-FABP的肝細(xì)胞能更明顯減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。Wang等[23]運(yùn)用膽管結(jié)扎大鼠模型研究L-FABP在肝臟的表達(dá)及抗氧化作用，結(jié)果顯示L-FABP表達(dá)上升后，ROS水平降低，肝功能血清總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)改善和血氨減少；在另一個將L-FABP基因轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)L-FABP可以減輕H2O2、缺氧所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷，提示L-FABP在肝細(xì)胞氧化應(yīng)激中有重要的抗氧化功能。L-FABP結(jié)構(gòu)中有1個半胱氨酸和7個甲硫氨酸，具有抗氧化作用，這些殘基可參與巰基的氧化還原,提高還原性谷胱甘肽的生成率。除此之外，L-FABP對脂肪酸和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物有高親和力和結(jié)合能力，發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化劑的重要作用，維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的平衡[24]。在生理狀態(tài)下，F(xiàn)FA與白蛋白結(jié)合，在線粒體或過氧化酶體內(nèi)氧化供能[25],在梗阻性黃疸，F(xiàn)FA可造成細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)如線粒體的腫脹等，還能形成ROS激活并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，發(fā)生持續(xù)的肝細(xì)胞壞死和凋亡，并且加重肝細(xì)胞脂肪變性進(jìn)展為脂肪肝，纖維化甚至肝硬化。L-FABP抗氧化作用及機(jī)制：在正常生理條件下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)氧自由基與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶等抗氧化酶類系統(tǒng)保持動態(tài)平衡[26]，在梗阻性黃疸狀態(tài)下此動態(tài)平衡打破，L-FABP結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸結(jié)合疏水性配體，能有效清除自由基，或作為抗氧化劑參與S-硫醇化/去硫醇化[25]。L-FABP中的甲硫氨酸氧化成亞砜甲硫氨酸，抑制了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，同時把甲硫氨酸亞砜還原酶還原成甲硫氨酸。這一系列催化反應(yīng)的凈化效果是活性氧轉(zhuǎn)化為無害產(chǎn)物，驅(qū)動NADPH氧化反應(yīng)。在梗阻性黃疸中甲硫氨酸氧化-還原循環(huán)發(fā)揮著重要的抗氧化作用。此外，L-FABP與ROS反應(yīng)來阻止磷脂氧化反應(yīng)的擴(kuò)大，從而保護(hù)細(xì)胞膜不被破壞，L-FABP還通過結(jié)合多不飽和脂肪酸來調(diào)節(jié)脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)氧化途徑的利用度，從而控制ROS的釋放量，同時L-FABP可能是通過調(diào)節(jié)FFA的代謝和發(fā)揮抗氧化作用來減輕氧化應(yīng)激損傷[27]。L-FABP在梗阻性黃疸的脂質(zhì)代謝起著重要調(diào)節(jié)作用，可為梗阻性黃疸患者的治療提供新的治療靶點(diǎn)。