微小膜殼絳蟲感染ICR小鼠后的蟲體生長發育情況和小腸組織的病理變化*

楊漢蕾，趙敬，張科，鄢宇航，門萬琪，皮煥婷，牟榮*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 人體寄生蟲學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 現代病原生物學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 臨床醫學院，貴州 貴陽 550004)

微小膜殼絳蟲(Hymenolepisnana,H.nana)，又稱短膜殼絳蟲，屬于膜殼科膜殼屬[1]，是一種人獸共患寄生蟲，也是幼兒較常感染的一種絳蟲，通常被稱為“侏儒絳蟲”，是因其體積小，長2～4 cm、寬1 mm[2-4]。H.nana成蟲寄生于人或嚙齒類動物小腸，以頭節吸盤附著在腸絨毛間的黏膜表面[3]；當H.nana性成熟時，末端孕節在腸道內分離、解體，之后釋放出蟲卵，并通過糞便排出蟲卵；這些蟲卵會立即產生感染性，且可以在環境中存活長達兩周。據估計，全世界H.nana感染人數大約有50 000 000～75 000 000[5-6]。相關證據表明，H.nana感染具有改善腸炎的能力，其引起的免疫調節機制能夠確定新的分子靶點，為炎癥性腸道疾病患者提供新的治療方案[7-9]。嚙齒類動物目前是實驗性哺乳動物絳蟲研究的主要對象，尤其是小鼠[10]。因此，建立H.nana感染小鼠的實驗動物模型可為后續開展H.nana所致炎癥性腸炎的相關研究提供動物模型。近年來，國內外報道了一系列H.nana感染脊椎動物和節肢動物的動物模型[11-12]，為建立H.nana感染小鼠動物模型奠定了理論基礎，但是這些研究均缺少對小鼠體質量變化以及腸組織病理變化的研究，且小鼠每克糞便蟲卵數(eggs per gram，EPG)檢測缺乏連續性和系統性。因此本實驗通過將野生小鼠小腸獲取的H.nana，以不同蟲卵量實驗感染ICR小鼠，觀測感染后不同時間小鼠的EPG、體質量和小腸組織病理學特征及檢獲蟲體形態學特征，以了解H.nana在小鼠腸內的生長發育情況和小鼠腸組織病理變化，為H.nana實驗感染ICR小鼠的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源、實驗動物、主要試劑及儀器

蟲體采自野生小鼠，經形態學和分子鑒定，確定采集蟲體為H.nana。6周齡ICR雌鼠購自貴州醫科大學實驗動物中心，體質量26～28 g，體健，經糞檢和間接凝集實驗證實無寄生蟲感染。稱量體質量后隔離飼養觀察3 d。嚴格隔離飼養，飲水瓶與鼠糧不能交叉污染，每周清洗更換3次飼養籠、飼料和墊料。Trizol購自美國Sigma公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，Nikon科研級成像系統(日本Nikon公司，Nikon DS-RI2)，PCR擴增儀(THCHNE，TC-512)、生物組織冷凍包埋機(BIOBAS EKD-BC，BK-BM)、生物組織切片機(德國徠卡，RM2016)。

1.2 H.nana蟲種鑒定

1.2.1形態學鑒定 將蟲體取出置于載玻片上，滴入生理鹽水使之舒展開，在普通光學顯微鏡下觀察其成蟲和蟲卵的形態[13]。取兩載玻片將H.nana蟲體壓平，棉線纏緊，于70 %的酒精里固定后行醋酸明礬卡紅染色[14]，二甲苯透明后用中性樹膠封片，觀察并拍照。

1.2.2野生小鼠體內獲取的蟲體分子生物學鑒定 取約5 mg成蟲，用酚氯仿法提取總DNA。以其為模板用COX1[15-17]特異性引物(COX1 上游引物5′-ACCGCGTCGTGTGTGTATTT-3′，COX1 下游引物5′-ACATGCAACTGGGCTCATACG-3′)進行PCR擴增，推測結果為COX1產物條帶202 bp。PCR反應體系：模板DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×TaqPCRMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳35 min，于紫外燈下觀察結果，凝膠成像系統拍照。將PCR 產物送上海生工公司進行測序，然后進行序列分析。

1.3 H.nana蟲卵的收集和計數

取數段H.nana的末段孕節，生理鹽水反復沖洗后以眼科剪充分剪碎使蟲卵逸出，待蟲體組織沉淀后收集上清，光學顯微鏡下觀察收集的蟲卵[18]，分別計數5次蟲卵量后取均值，每次計數蟲卵懸液6 μL，最后定量為生理鹽水0.3 mL中含1 000個蟲卵備用。

1.4 分組

168只、6周齡、體質量約26 g的ICR小鼠分為6組，5個實驗組和1個對照組,每組28只。5個實驗組分別以60、100、300、500、1 000個蟲卵灌胃感染,生理鹽水灌胃的小鼠作為對照組。

1.5 觀察指標

1.5.1一般情況與體質量實驗組和對照組每組隨機選8只小鼠標記，每日觀察小鼠活動情況，連續記錄小鼠體質量25 d，小鼠相對體質量=小鼠體質量/小鼠初始體質量×100。

1.5.2糞檢蟲卵 使用改良加藤法[19]檢測檢測小鼠糞便EPG，連續檢測25 d，根據記錄結果作排卵趨勢圖。

1.5.3剖檢獲取蟲體觀測 小鼠在感染后第5、10、15、20、25 d，每組隨機選取5只小鼠麻醉處死，打開腹腔，取出小腸，放置于裝有預冷生理鹽水(0 ℃)的培養皿中10 min，然后解剖并收集蟲體，觀察腸內H.nana的發育狀況。

1.5.4組織學觀察 感染后第5、10、15、20、25天，取 5個實驗組和對照組的小腸，經多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片并做蘇木精-伊紅染色(hymatoxylin-eosin stain，H&E stain)。

1.5.5腸組織的DNA提取 挑選出觀察到蟲體的蠟塊組織提取其中的總DNA，以其為模板利用COX1特異性引物進行PCR擴增。將石蠟包埋的組織切成厚10 μm的薄片，取10 張切片用二甲苯常規脫蠟后，使用75%酒精和無菌水各洗滌3次，然后采用酚氯仿法提取總DNA，DEPC水溶解后采用分光光度計測定DNA的濃度和純度[20-21]。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 H.nana蟲種鑒定

將野生小鼠體內獲得的蟲體置于顯微鏡下觀察，發現蟲體頭節有4個吸盤以及一個可自由伸縮的頂突；劃破孕節使蟲卵逸出，可見卵殼較薄，胚膜兩端凸起發出絲狀物，內有一六鉤蚴(圖1a、圖1b)；明礬醋酸卡紅染色后鏡下可清晰看到蟲體頂突上有一圈小鉤，成節內有3個圓球形睪丸和發達的儲精囊(圖1c、圖1d)。此外，蟲體DNA的PCR擴增結果顯示在約200 bp位置有一特異性條帶，與分子生物學鑒定的COX1產物條帶為202 bp的預期結果大致相符(圖2)。同時PCR 產物測序及序列比對結果表明，所克隆的基因片段與GenBank中記錄的COX1參考株核苷酸序列同源性為99%。

注：a為蟲卵(400×)；b為成蟲(100×)；c為頭節(200×)，箭頭所示為小鉤；d為成熟節片(400×)；a、b為生理鹽水涂片，c、d為醋酸明礬卡紅染色。圖1 野生小鼠體內獲取的微小膜殼絳蟲形態Fig.1 Morphology of H.nana in wild mice

注：M為DNA分子質量標準，1為COX1核酸擴增產物。圖2 野生小鼠體內獲取的蟲體DNA PCR擴增圖Fig.2 PCR amplification of insect DNA obtained from wild mice

2.2 小鼠一般情況與體質量

感染后第3天,小鼠出現精神萎靡、食量下降、活動減少、皮毛色澤變暗、毛發蓬亂等癥狀，癥狀隨蟲卵感染量加重。感染量為60、100和300個蟲卵的實驗組小鼠體質量與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與對照組比較，感染量為500個蟲卵的實驗組小鼠體質量在感染后第2天明顯減輕(P<0.05)，感染量為1 000個蟲卵的實驗組小鼠體質量在感染后第2天和第7天也明顯減輕(P<0.05)。見圖3。

2.3 糞檢結果

不同蟲卵感染量的實驗組小鼠，在感染后第12天從糞便中檢獲蟲卵，感染率為100%，證明蟲體在感染后第12天已經發育成熟，完成一個生活史。感染500個蟲卵的實驗組檢出蟲卵時間最早、排卵持續時間最長，H.nana感染ICR小鼠動物模型建立可參考該感染量，見表1。

表1 各組H.nana感染ICR小鼠糞檢蟲卵情況Tab.1 The results of eggs detected from the feces of ICR mice infected with H.nana

注：(1)與對照組比較，P<0.05。圖3 實驗組和對照組小鼠的相對體質量Fig.3 Relative weight of mice in experimental group and control group

2.4 剖檢蟲體觀測

感染后第5天未檢獲蟲體。感染后第10天感染量為60個蟲卵的實驗組有3只小鼠檢獲蟲體，成蟲檢獲率60%；感染量為100、300、500、1 000個蟲卵的實驗組小鼠均檢獲蟲體，成蟲檢獲率100%，蟲體主要分布于距回盲部6～12 cm處的小腸內。感染后第15、20、25天所有實驗組小鼠小腸內均發現成蟲，成蟲檢獲率100%，蟲體主要分布于距回盲部1～8 cm處的小腸內。見圖4。

注：箭頭A所指為H.nana蟲體，箭頭B所指為回腸末端。圖4 感染小鼠小腸內獲取的微小膜殼絳蟲成蟲Fig.4 Adult H.nana isolated from the small intestine of infected mice

2.5 小腸組織觀察及蠟塊組織PCR檢測

2.5.1小腸組織觀察 感染第5天感染量為1 000個蟲卵的實驗組及感染第15天60個蟲卵的實驗組小鼠的組織切片中發現，小鼠后三分之一的小腸黏膜內含有似囊尾蚴(圖5a)，在腸絨毛之間發現帶有吸盤和鉤狀物的成蟲頭節和頭節后未分節的細長頸部(圖5b、圖5c)、以及含有雌雄生殖系統的成蟲節片(圖5d)，認為H.nana從幼蟲到成蟲的發育過程是一個從腸壁逐漸向腸腔的遷移過程。與對照組比較，感染后25 d內實驗組H.nana感染處腸組織病理切片均未觀察到損傷修復肉芽腫組織，但是炎癥細胞增多，特別是嗜酸性粒細胞增多明顯。

2.5.2小腸蠟塊組織的PCR檢測 結果約200 bp有一特異性條帶，與分子生物學鑒定的COX1產物條帶為202 bp的預期結果大致相符(圖6)，表明小鼠腸道內寄生的確為H.nana。

注：a箭頭所示為似囊尾蚴(400×)，b箭頭所示為成蟲頭節(200×)，c箭頭所示為成蟲頭節和頸部(200×)，d為成蟲成熟節片(100×)。圖5 微小膜殼絳蟲感染小鼠小腸組織切片(HE)Fig.5 Section of small intestine in mice infected with H.nana(HE)

注：M為DNA分子質量標準，1為COX1核酸擴增產物。圖6 感染組小鼠小腸蠟塊組織的PCR擴增情況Fig.6 PCR detection of intestinal tissue of the worm found in HE staining section

3 討論

H.nana是一種常見的絳蟲，分布于世界各地，主要發現于發展中國家的兒童體內。人類膜殼絳蟲病是一種全球性流行的人畜共患病，由H.nana和縮小膜殼絳蟲引起[22]。H.nana在亞洲、南歐和東歐、中美洲和南美洲以及非洲流行，其生活在人類、小鼠和大鼠的小腸中，它主要通過含有卵的糞便或以中間宿主昆蟲為載體進行傳播。H.nana也能夠在一個宿主中完成其整個生命周期，因此能夠自體感染。張維真等[23]研究報道，H.nana蟲卵孵化出六鉤蚴的時間大約需要2～ 3 d。

本實驗結果顯示，感染量為60～1 000個鼠源性H.nana蟲卵均能感染ICR小鼠,且感染后第2天，500個蟲卵感染量和1 000蟲卵感染量的實驗組小鼠體質量均較對照組明顯減輕。結合張維真等[23]所報道的結果，推測感染后第2天H.nana蟲卵孵化出六鉤蚴后鉆入小鼠腸絨毛對其造成損傷，同時蟲卵孵化過程中的代謝分泌物也會刺激小鼠腸壁，導致腸壁吸收功能障礙，從而使感染組小鼠體質量下降。本實驗糞檢蟲卵的結果顯示，實驗組小鼠的感染率為100%，蟲體在感染后約第12天發育成熟，這與Thompson[24]研究中所報道的約2周時間相符合，其中感染500個蟲卵的實驗組蟲體和蟲卵檢獲時間一致性最高，反應了蟲體發育狀況良好。500個蟲卵感染量的實驗組小鼠體內蟲體發育良好的原因可能是小鼠體型較小，其腸道無法負擔過多的蟲卵感染有關；本研究中也發現1 000個蟲卵感染量的實驗組小鼠體質量下降更明顯，排卵持續時間反而更短。因此適量的蟲卵感染量可維持H.nana與小鼠相互作用的平衡關系，一方面小鼠的自身免疫力不會完全清除感染的蟲卵，另一方面部分蟲卵可以在小鼠小腸內繼續生長發育成熟。Fan等[12]曾報道以20個H.nana蟲卵感染小鼠，感染19～33 d后檢測的成蟲感染率僅為33%。因此可將500個蟲卵感染量作為參考以建立H.nana感染ICR小鼠動物模型。

本實驗的組織病理切片結果顯示，在實驗組小鼠距離回盲部1～12 cm處的小腸內可見似囊尾蚴、成蟲頭節、頸部以及成蟲節片，腸粘膜未見損傷修復肉芽腫組織，但是炎癥細胞增多，尤以嗜酸性粒細胞增多明顯，這與Hench等[10]報道的情況基本一致，在檢測中并沒有發現與宿主排斥反應有關的變化，如組織正常結構的喪失、水腫、混合細胞浸潤或上皮糜爛，但是炎癥性細胞明顯增多。從進化角度來說，寄生蟲對宿主的傷害越小越好。Hench等[10]的研究是基于1例自然感染的病患，而本實驗是取野生小鼠體內的H.nana蟲卵感染ICR小鼠。有研究報道，人、嚙齒類動物的H.nana雖屬于同種生物，但其生理型并不相同，當改變宿主后其生理型會逐漸改變，這其中的機制尚不明確。

本實驗設計尚存在不足之處，實驗過程中可能存在自體感染的問題，比如感染后12 d，有可能存在自身感染，這對后續實驗結果的分析會造成干擾，因此今后在建立H.nana實驗感染ICR小鼠動物模型時可以將實驗時間控制在12 d以內，來排除自體感染的干擾，以利于開展進一步的相關研究。