狼瘡性腎炎病人腎臟巨噬細胞浸潤與血和尿TNF-α水平的關系

[摘要]目的觀察狼瘡性腎炎（LN）病人腎組織巨噬細胞的局部浸潤情況，探討其與病人血清、尿液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的關系。方法選取60例經腎組織活檢診斷為LN病人和10例腎組織正常病人（對照組）為研究對象。采用免疫組織化學染色方法觀察腎組織中巨噬細胞的浸潤情況，酶聯免疫吸附試驗雙抗體夾心法測定血清、尿液TNF-α水平，并對兩者進行相關性分析。結果60例LN病人中，活動組34例（SLEDAI≥9分定義為疾病活動），非活動組26例。LN病人腎組織巨噬細胞表現出異常激活，即浸潤程度較對照組明顯增高，且活動組明顯高于非活動組（F=56.085，P<0.01）。LN病人血清、尿液中TNF-α水平較對照組明顯升高，且活動組明顯高于非活動組（F=50.234、52.982，P<0.01）。Pearson直線相關分析顯示，LN病人腎組織巨噬細胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平有明顯相關性（r=0.728、0.716，P<0.01）。結論LN病人腎組織中巨噬細胞浸潤明顯增多，巨噬細胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平呈正相關，且與腎臟損傷和疾病活動性存在明顯相關性。

[關鍵詞]狼瘡腎炎;巨噬細胞;腫瘤壞死因子α

[中圖分類號]R593.242[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0091-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate local macrophage infiltration in the renal tissue of patients with lupus nephritis （LN） and its correlation with the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in serum and urine. MethodsA total of 60 patients with LN diagnosed by renal biopsies and 10 subjects with normal renal tissue were enrolled. Immunohistochemistry was used to observe macrophage infiltration in renal tissue， double-antibody sandwich ELISA was used to measure the level of TNF-α in serum and urine， and a correlation analysis was performed. ResultsAmong the 60 patients with LN， 34 had an active disease （a Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index of ≥9 was defined as active systemic lupus erythematosus） and 26 had a non-active disease. The patients with LN had abnormal activation of macrophages in renal tissue， with a significantly higher degree of macrophage infiltration than the normal control group， and the active group had a significantly higher degree of macrophage infiltration than the non-active group （F=56.085，Plt;0.01）. Compared with the normal control group， the patients with LN had significant increases in the level of TNF-α in serum and urine， and the active group had significantly higher levels than the non-active group （F=50.234，52.982;Plt;0.01）. The Pearson linear correlation analysis showed that renal macrophage infiltration was significantly correlated with the level of TNF-α in serum and urine in patients with LN （r=0.728，0.716;Plt;0.01）. ConclusionPatients with LN have a significant increase in macrophage infiltration， which is positively correlated with the level of TNF-α in serum and urine and is significantly correlated with renal injury and disease activity.

[KEY WORDS]lupus nephritis; macrophage; tumor necrosis factor-alpha

系統性紅斑狼瘡（SLE）多見于青年女性，是一種自身免疫性疾病，其臨床表現復雜多樣，主要特征是產生大量自身抗體以及多系統受累。腎臟為其最常見和嚴重的損害器官，腎活檢顯示SLE幾乎全部存在腎臟受累[1]，其中50%～80%有腎炎表現，即為狼瘡性腎炎（LN）。LN嚴重影響病人預后，因此及時有效地診斷及治療至關重要。免疫調節失衡與炎癥反應是LN的主要特征，同時也是LN的重要發病機制[2]。而巨噬細胞是人體免疫系統的重要組成部分，是炎癥反應中最主要的調節細胞和免疫反應中最重要的吞噬細胞，已證實活化的巨噬細胞在LN 的發病機制中起關鍵性作用。巨噬細胞可以直接損傷腎臟固有細胞，還可以分泌多種細胞因子導致炎癥細胞浸潤和廣泛的細胞增生。有研究結果顯示，巨噬細胞廣泛參與LN小鼠的增生性病變，若特異性地清除巨噬細胞則可明顯抑制LN的增生性病變[3]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由單核細胞、巨噬細胞以及T淋巴細胞等分泌，在免疫細胞間起著相互聯系的介導作用[4]，決定免疫應答的性質，因此研究TNF-α在LN中的表達具有重要的臨床價值。目前，國內有關LN病人腎組織中巨噬細胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平關系的研究報道甚少。故本研究對二者的關系進行了分析，旨在進一步探討LN的發病機制，為LN病人提供活動性預測及藥物治療反應性評估的無創性指標。

1對象和方法

1.1研究對象

2017年12月—2019年6月，青島大學附屬醫院腎病科及風濕免疫科收治的有完整病情記錄的LN病人60例（年齡≥18歲）。60例LN病人均符合美國風濕協會SLE的分類診斷標準且經腎穿刺活檢術證實為LN[5]。所有病人均無類風濕性關節炎、銀屑病、中樞神經系統疾病、感染性疾病等，非妊娠及哺乳期婦女，均無腎臟原發性損害及糖尿病、高血壓等繼發的腎臟損害，近3個月內無服用免疫抑制劑史或3個月內使用潑尼松的劑量<30 mg/d。60例病人，男18例，女42例，平均年齡（32.30±9.41）歲。根據LN病理類型將病人分為Ⅲ型組12例，Ⅳ型組18例，Ⅴ型組16例，Ⅴ+Ⅳ型組14例。根據疾病活動性（SLEDAI≥9分定義為SLE疾病活動）將病人分為活動組34例和非活動組26例。另選擇10例腎組織正常的病人作為對照組（腎組織標本為外傷手術標本及腎移植供腎活檢標本），均無其他原發性及繼發性引起腎損害的情況。對照組10例病人，男3例，女7例，平均年齡（30.40±6.45）歲。LN組病人與對照組性別、年齡比較差異均無顯著性（P>0.05）。

1.2血、尿及腎組織標本采集

所有研究對象于清晨空腹狀態下采集上肢靜脈血3 mL，分離血清置于-80 ℃凍存待用;收集所有研究對象晨起中段尿10 mL，離心后置于-80 ℃凍存待用。LN病人均行腎組織活檢術采集腎組織標本。在穿刺前告知腎組織活檢術必要性及相關風險，病人及家屬同意后簽訂知情同意書。病人俯臥于硬板床上，在B超下定位，標記穿刺部位，常規皮膚消毒，鋪無菌洞巾，以10 g/L利多卡因局部麻醉，用穿刺針快速取得1 cm左右腎組織1～2條，用40 g/L甲醛固定，石蠟包埋后制成2 μm厚切片。

1.3免疫組織化學檢測腎組織巨噬細胞的浸潤

腎組織石蠟切片常規脫蠟至水后，用枸櫞酸鈉修復液微波熱修復10 min，冷卻后洗片3次，每次7 min。用體積分數0.03的過氧化氫溶液浸泡組織10 min，洗片后加入10 g/L的BSA 30 μL，37 ℃孵育1 h。洗片后加入CD68單克隆抗體（1∶50，Santa Cruz，美國）30 μL，37 ℃孵育1.5 h。洗片后加入山羊抗鼠HRP酶標二抗（1∶500，abcam，英國）30 μL，37 ℃恒溫孵育20 min。洗片后加入DAB底物30 μL避光孵育5 min進行顯色，顯色結束后用自來水輕洗5 min。用蘇木精染核30 s，自來水輕洗5 min。脫水、封片，光鏡下觀察，攝片保存，應用圖像軟件進行圖像半定量分析。

1.4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清、尿液TNF-α水平

應用人TNF-α ELISA試劑盒（Elabscience Biotechnology Co.， Ltd），采用雙抗體夾心法測定血清、尿液中TNF-α表達水平，嚴格按照說明書進行操作。

1.5統計學處理

計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩變量關系分析采用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1免疫組織化學檢測

對照組腎組織中幾乎無巨噬細胞浸潤（圖1A），LN病人與對照組腎臟比較有明顯的巨噬細胞浸潤（圖1B～E），巨噬細胞主要分布于腎小球且呈散在或者簇狀分布，腎小管間質中較少浸潤。對照組、LN活動組和LN非活動組CD68+細胞數分別為1.26±0.59、45.01±21.43和9.18±2.20。LN病人腎組織巨噬細胞浸潤程度較對照組明顯增高，且活動組明顯高于非活動組（F=56.085，P<0.01）。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組LN 病人腎組織中有明顯巨噬細胞浸潤，且其浸潤程度與Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組LN病人比較差異均有顯著意義（F=67.977，P<0.01），而Ⅲ型組和Ⅴ型組LN病人間差異不明顯（圖1F）。

2.2ELISA檢測

LN病人血清、尿液中TNF-α的表達水平較對照組明顯升高，且活動組明顯高于非活動組（F=50.234、52.982，P<0.01）。不同病理類型組間比較，Ⅳ型組病人血清、尿液中TNF-α水平較Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型組明顯增高，Ⅴ+Ⅳ型組病人尿液中TNF-α水平較Ⅲ型組明顯增高，差異均有統計學意義（F=53.103、68.381，P<0.01）。見表1、2。

2.3腎組織巨噬細胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平的相關性

Pearson直線相關分析顯示，LN病人腎組織巨噬細胞浸潤與血清、尿液TNF-α水平有顯著相關性（r=0.728、0.716，P<0.01）。

3討論

LN是SLE病人最常見的并發癥之一，嚴重影響SLE病人的預后，因此探討其具體發病機制和尋求新的治療方法尤為重要。LN的臨床表現多樣，從單純性蛋白尿至腎炎綜合征、腎病綜合征、急進型腎炎和腎衰竭等[6]，與腎臟病理的多樣性相平行。目前蛋白尿仍是LN病人疾病活動最主要的臨床表現，也是影響病人預后的重要指標。尋找新的相關生物標記物對LN活動性預測、疾病治療及預后評估有重要意義。近年來，腎臟疾病中巨噬細胞的浸潤受到越來越多的關注，在大多數腎臟病中巨噬細胞起著重要作用，巨噬細胞浸潤與腎組織受損（新月體形成、腎間質纖維化等）、尿蛋白水平及腎功能減退等明顯相關。本課題組前期研究顯示，巨噬細胞是介導LN病人腎組織損傷的重要細胞，與LN病變嚴重程度有密切關系[7]，尤其在活動期病人中表現格外明顯，且干預巨噬細胞在腎組織的浸潤能夠改善這種腎臟損傷[8]。不同病理類型LN病人，特別是表現為彌漫增殖性病變的Ⅳ型LN病人和表現為膜性病變的Ⅴ型LN病人，其臨床特征和病理表現相差甚大，提示其免疫發病可能存在不同的機制。本課題組前期研究顯示，與對照組腎臟相比較，LN病人腎小球中巨噬細胞浸潤明顯增多，腎臟中巨噬細胞的大量浸潤是引起腎組織學病變的機制之一[9]。本文研究顯示，LN病人腎臟巨噬細胞浸潤較對照組明顯增加，且不同病理類型的LN巨噬細胞浸潤程度不同。Ⅳ型LN的活動性明顯高于其他類型LN，且病人腎組織巨噬細胞浸潤程度高于Ⅲ型、Ⅴ型及Ⅴ+Ⅳ型LN，差異具有統計學意義，表明不同病理類型LN的發病機制、疾病活動性及嚴重程度有很大差異。LN活動組與非活動組巨噬細胞浸潤亦有明顯差異，提示巨噬細胞浸潤參與LN發病且其浸潤程度可能與疾病的活動性有關[10]。

TNF-α能抑制急性自身反應淋巴細胞的正常生理作用，致使機體內淋巴細胞在發育過程中出現凋亡異常從而導致自身耐受平衡被破壞，然后通過自分泌途徑誘導多種免疫細胞因子，激活以及產生一系列自身抗體致使多臟器免疫損傷。國內外新近研究證實，TNF-α在自身免疫反應與炎癥反應的調控中至關重要[11-12]，且在LN的異常免疫調節中亦起到了重要的作用，與LN的發生發展和轉歸有著密切聯系[13]，其可能成為早期預測LN發生的相關標志。本文的研究結果顯示，LN病人血清和尿液的TNF-α表達水平明顯升高，且與腎組織巨噬細胞浸潤呈正相關，活動期的LN與非活動期相比較，TNF-α表達亦明顯升高，表明腎組織TNF-α高表達在LN的發病過程中同樣發揮重要作用[14]，并與LN的疾病活動性密切相關，提示TNF-α可能通過促進LN病人腎臟的巨噬細胞浸潤引起疾病發生及腎臟損傷。

綜上所述，LN病人發病與免疫調節失衡有密切聯系，其中包括巨噬細胞的腎臟浸潤，且浸潤程度與疾病活動性密切相關。LN病人巨噬細胞浸潤與血清、尿液的TNF-α水平呈正相關，提示血清、尿液TNF-α水平可能成為判斷病人疾病活動性及嚴重程度的指標之一。雖然巨噬細胞與LN的發病機制有密切聯系，其中包括腎臟足細胞的損傷，但是不同表型巨噬細胞的浸潤對腎臟損傷的影響在國內外研究甚少，本課題組后續將進一步研究腎臟不同表型巨噬細胞浸潤與LN病人足細胞損傷關系，為LN的活動性預測及疾病治療提供依據。

[參考文獻]

[1]WANG H P， WANG C Y， PAN Z L， et al. Relationship between clinical and immunological features with magnetic resonance imaging abnormalities in female patients with neuropsychiatric systemic lupus erythematosus[J]." Chin Med J， 2016，129（5）：542-548.

[2]MOHAN C， PUTTERMAN C. Genetics and pathogenesis of systemic lupus erythematosus and lupus nephritis[J]." Nat Rev Nephrol， 2015，11（6）：329-341.

[3]YUNG S， YAP D Y， CHAN T M. Recent advances in the understanding of renal inflammation and fibrosis in lupus nephritis[J]." F1000Research， 2017，6：874.

[4]KALLIOLIAS G D， IVASHKIV L B. TNF biology， pathogenic mechanisms and emerging therapeutic strategies[J]." Nat Rev Rheumatol， 2016，12（1）：49-62.

[5]HOCHBERG M C. Updating the American college of rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus[J].nbsp; Arthritis amp; Rheumatism， 1997，40（9）：1725.

[6]YAP D Y， CHAN T M. Lupus nephritis in Asia： clinical features and management[J]." Kidney Dis Basel Switz， 2015，1（2）：100-109.

[7]孫益婷，王祥花，李明慧，等. 狼瘡腎炎患者腎組織巨噬細胞浸潤與骨橋蛋白表達的關系[J]." 中華風濕病學雜志， 2019，23（3）：175-178，后插2.

[8]CHALMERS S A， CHITU V， HERLITZ L C， et al. Macrophage depletion ameliorates nephritis induced by pathogenic antibodies[J]." J Autoimmun， 2015，57：42-52.

[9]王瑩，李明慧，張巖，等. 狼瘡性腎炎患者足細胞損傷與腎組織巨噬細胞浸潤的關系[J]. 北京大學學報（醫學版）， 2019，51（4）：723-727.

[10]ZIZZO G， GUERRIERI J， DITTMAN L M， et al. Circulating levels of soluble MER in lupus reflect M2c activation of monocytes/macrophages， autoantibody specificities and disease activity[J]." Arthritis Res Ther， 2013，15（6）：R212.

[11]趙媛，王宏亮，張麗華，等. 系統性紅斑狼瘡患者外周血IL-17、TNF-α和INF-γ表達水平及臨床意義[J]." 解放軍醫藥雜志， 2017，29（6）：86-88.

[12]FLEISCHER V， SIEBER J， FLEISCHER S J， et al. Epratuzumab inhibits the production of the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α， but not the regulatory cytokine IL-10， by B cells from healthy donors and SLE patients[J]." Arthritis Res Ther， 2015，17：185.

[13]凌磊，皮肖冰，余旸弢，等. 系統性紅斑狼瘡患者血清干擾素-α的水平變化及其臨床意義[J]." 實用醫學雜志， 2016，32（1）：106-108.

[14]CIGNI A， PILERI P V， FAEDDA R， et al. Interleukin 1， interleukin 6， interleukin 10， and tumor necrosis factor α in active and quiescent systemic lupus erythematosus[J]." Journal of Investigative Medicine， 2014，62（5）：825-829.

（本文編輯 馬偉平）